利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，利用结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物样(Transcriptional‑activator‑like effectors,Tale)的抑制性转录因子R6联合Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc之间的协同作用提高小鼠成纤维细胞向诱导性多能干细胞的诱导效率。而且获得的iPSCs具有典型的多能性干细胞特性，包括参与嵌合体小鼠的发育。该方法不仅积极推进了iPSCs的临床应用和研究，而且为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。

【技术实现步骤摘要】
利用XistTale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法
本专利技术属生物
，涉及一种利用XistTale抑制性转录因子联合Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc制备诱导性多能干细胞的方法。
技术介绍
胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESCs)是一类高度未分化细胞，具有发育全能性。在适当条件下可以无限增殖，并可以分化出成体动物组织和器官的所有细胞，如造血细胞、神经细胞、心肌细胞等。在动物克隆、转基因动物生产、疾病治疗、组织工程、再生医学、疾病机理和治疗研究、药物发现和评价等诸多领域均具有应用价值。但是伦理法律以及免疫排斥等问题一直制约着ESCs技术的进一步发展和应用。2006，日本科学家通过导入4种转录因子Oct4，Sox2，c-Myc，Klf4成功将鼠的体细胞重编程为ESCs状态，即诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)，随后，人的iPSCs也用相似的基因改造方法获得。iPSCs具有与ESCs类似的生物学特征，包括具有分化出成体动物组织和器官的所有细胞的能力，如神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞，造血前体细胞、造血细胞、血管内皮细胞，分泌胰岛素的β细胞，心肌细胞等。2009年，中国科学家周琪、曾凡一、高绍荣等利用iPSCs获得活体实验鼠，首次证明iPSCs与ESCs一样具有全能性。而且，由于iPSCs来源于自体细胞的重编程，较好地回避了长期以来围绕人类胚胎干细胞使用问题的伦理争论，同时也克服了异体移植存在的免疫排斥问题。这是科学史上的重大突破，在干细胞、发育生物学和医学研究领域中具有划时代意义。但人们对iPSCs技术的研究尚在初级阶段，其效率低是iPSCs应用面临的主要障碍之一。在各种诱导方法中，逆转录病毒载体诱导细胞重编程效率最高，也仅为0.01％左右，慢病毒、腺病毒更低。如何获得高效的iPSCs技术成为目前国际上干细胞研究领域的热点。iPSCs转化技术的核心是如何通过异源表达Oct4、Sox2等基因快速启动细胞内源性Oct4、Nanog等多能相关性基因的表达。在胚胎干细胞中，多能性调控因子OCT4、SOX2和NANOG等结合到Xist第一内含子区，以调控和维持XistRNA的低水平状态。最近研究发现，在Xist第一内含子区结合的因子还包括多能性调控因子TCF3和PRDM14，以及早期胚胎发育调控因子CDX2等。而且有研究报道，Xist第一内含子在ESCs分化过程中具有增强子活性。作为多能性因子结合的关键区域，Xist第一内含子区的表观修饰状态可能与MEFs细胞的重编程息息相关，甚至可以提高iPSC的诱导效率。类转录激活效应物(Transcriptional-activator-likeeffectors,TALEs)蛋白家族是来自于植物病原体-黄单胞杆菌的天然细菌效应蛋白。它与真核生物的转录因子相似，通过识别特异DNA序列来调节宿主基因转录，并促进细菌定植。人工体外合成的TALEs蛋白已经运用到基因工程的多个方面，包含具有基因组剪辑作用的类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和起基因转录修饰和调控作用的Tale-dTFs等，其中Tale-dTFs包含抑制性效应因子(TALEbaseddesignertranscriptionRepressors,TaleR-dTF)和激活性效应因子(TALEbaseddesignertranscriptionactivators,TaleA-dTF)，它们的TALE蛋白分别与抑制结构域(如KRAB等)和激活结构域(如VP64)相连接，最终通过在结合位点募集各种不同的转录调控因子而达到改变结合位点的表观遗传修饰状态并调控靶基因开关的目的。而且，Tale-dTFs已成功地应用于MEF细胞的重编程及干细胞的分化、转分化实验中。因此，利用结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子建立高效获得iPSCs的方法，不仅积极推进了iPSCs的临床应用和研究，而且为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种利用XistTale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：1.细胞制备获取胎鼠的成纤维细胞(mouseembryofibroblast，MEF)，选择生长状态良好的MEF，丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层。获取Oct4-GFPMEFs，选择生长状态良好的Oct4-GFPMEF，用于电转染并制备iPSCs。2.建立高效获得诱导性多能干细胞的方法在建立高效获得诱导性多能干细胞的方法中，利用含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的PiggyBac载体和XistTale抑制性转录因子转染。添加四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和结合于Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子R6为实验组，含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的单独处理或联合无特异性结合位点的ConR作为对照组，以确定不同组合转染Oct4-GFPMEFs获得iPSCs的效率，从而进一步确定高效获得iPSCs的方法。电转染按照常规方法进行：利用电穿孔法将四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc及XistTale抑制性因子R6转染入生长良好的Oct4-GFPMEFs；。第二天将培养基更换为添加Dox的iPSC诱导用液体培养基(M15)，直到克隆形成，对克隆并进行碱性磷酸酶检测或挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养，进而进行诱导性多能干细胞生物学特征检测。对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞。显微镜下观察细胞形态变化。根据克隆形成情况，诱导25-30天后，确定各种方法获得iPSCs的效率；或对克隆进行机械传代以扩大培养，并进一步对获得的克隆进行生物学特征的鉴定。3.iPSCs生物学特征鉴定碱性磷酸酶AP活性检测，以确定获得的ESCs样克隆是否为AP染色阳性。免疫荧光检测获得的ESC样克隆中ESCs相关蛋白的表达，抗体分别为anti-Oct4和anti-Nanog。对于核蛋白，需要进行PBT(PBS+0.1％Triton-100)处理，以使相应的抗体进入细胞核中与相应抗原结合。通过体外和体内分化实验研究ESCs样克隆的分化潜能。体外分化利用拟胚体的形成以及拟胚体的自发分化形成各种细胞进行验证。体内分化潜能研究是将获得的ESC样克隆注射入NOD-SCID小鼠，观察畸胎瘤形成并分析畸胎瘤中三胚层分化情况。RT-qPCR检测获得的ESC样克隆中ESCs多能基因表达，如Oct4、Sox2、Nanog等。利用嵌合体制备技术研究ESC样细胞是否可以参与小鼠的正常发育，以确定ESC样细胞参与个体形成和发育的能力。本专利技术的有益效果是：该方法提高了小鼠iPSCs的诱导效率，不仅积极推进了iPSCs的临床应用和研究，也为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。。附图说明图1是本专利技术具体技术流程；图2是本专利技术中XistTale抑制性效应因子R6的结构示意图；图3是本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞制备获取胎鼠的成纤维细胞MEF，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层；获取Oct4‑GFP MEFs；2)获得诱导性多能干细胞A、Oct4‑GFP MEF细胞的电转染：当Oct4‑GFP MEF细胞达到80％汇合度时，用0.5g/L的胰蛋白酶‑0.02％EDTA消化液于37℃消化5min，用等量的培养液中止消化，并对细胞计数，取1×10

【技术特征摘要】
1.一种利用XistTale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞制备获取胎鼠的成纤维细胞MEF，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层；获取Oct4-GFPMEFs；2)获得诱导性多能干细胞A、Oct4-GFPMEF细胞的电转染：当Oct4-GFPMEF细胞达到80％汇合度时，用0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液于37℃消化5min，用等量的培养液中止消化，并对细胞计数，取1×106个细胞/电转体系，以1300rpm离心5min；弃上清后用100μL电转液重悬细胞；再将细胞移入电转杯中，用电转仪进行电激；向电转杯中加入500μL提前预热的培养液，最后将细胞悬液接种到事先准备好的铺有步骤1)中饲养层细胞的培养皿中进行培养；上述100μL电转液为包含1.0μgTRE-Oct4、2.0μgTRE-CKS、1.0μg转座酶HyBase、及1.0μgCAG-rtTA的Opti-M...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金吨，李喜和，刘澎涛，梁延峰，范丽红，韩红梅，
申请(专利权)人：内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15