稳定表达牛胰蛋白酶原的Vero细胞系及其用途制造技术

本发明专利技术提供一株稳定分泌表达牛胰蛋白酶原(S.pro‑try)的Vero细胞系，及其在培养流感病毒、生产流感病毒疫苗中的应用，命名为VTY55，其保藏号为CGMCC No.12680，属于生物技术领域。本发明专利技术还提供一种构建所述Vero‑S.pro‑try细胞系的方法。本发明专利技术所提供的Vero‑S.pro‑try单克隆细胞系VTY55，一方面为将来大规模流感疫苗生产奠定细胞基础，解决疫苗产能扩大和品质提高的关键问题；另一方面也可以作为实验室有效分离培养和监测流感病毒、抗流感病毒药物的筛选、中和抗体的测定等其他方面的研究工具，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
稳定表达牛胰蛋白酶原的Vero细胞系及其用途
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及工程细胞系克隆Vero-S.pro-try及其构建方法，以及所述细胞系在培养流感病毒、制备流感疫苗、抗流感病毒药物筛选、中和抗体测定或者流感其他相关研究等方面的应用。
技术介绍
流感疫苗是目前预防流感发生和传播最为有效的手段。现行市场上人流感疫苗多数以鸡胚为基质进行生产，包含甲型H1N1、H3N2和乙型流感病毒株。传统的鸡胚生产系统已有近70年的历史，疫苗的免疫效果已得到充分证实，但其自身仍存在一些不足之处，比如培养的流感病毒易发生抗原变异，与人群流行株不能完全匹配；残留卵清蛋白易引起过敏反应；尤其当出现大流行时健康鸡胚供应受限不能满足短时间内对疫苗的大量需求等。而哺乳动物细胞培养系统相较鸡胚具有明显的优势,能够避免这些问题，成为未来疫苗生产的发展趋势，1995年WHO建议开展以哺乳动物细胞为生产基质的研究。目前已探索适用的哺乳动物细胞包括非洲绿猴肾细胞(Africangreenmonkeykidneycell，Vero)、犬肾上皮细胞(Madin-Darbycaninekidneycells，MDCK)以及人胚胎成视网膜细胞PER.C6。其中Vero细胞是WHO推荐的用于疫苗生产病毒培养的哺乳动物细胞系。现多厂家开展Vero细胞培养流感病毒疫苗相关研究。临床试验表明使用Vero等细胞生产的流感疫苗是安全的并有高免疫原性，然而较低的病毒滴度是其大规模生产的瓶颈之一。在生产体系的复杂环境中造成低滴度原因是多方面的，单从细胞基质的角度来讲，这种细胞本身并不表达裂解HA的蛋白酶类，成为病毒产量低的一种限制因素。流感病毒血凝素HA是病毒主要表面抗原之一，在识别并结合靶细胞受体、介导膜融合、诱导保护性中和抗体方面发挥重要作用。在病毒复制过程中，HA蛋白首先以前体HA0形式合成，经宿主蛋白酶裂解为成熟的HA1和HA2后，才能够介导病毒囊膜与靶细胞膜融合，起始病毒生命周期，因此HA的裂解是病毒感染细胞的首要前提，而Vero细胞本身并不具备裂解HA的蛋白酶类，研究证明外加一定量的胰蛋白酶能够加速病毒胞间传播，提高病毒滴度，加速病毒多周期生长，现已成为流感病毒细胞培养的常规操作。胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族，其C端长220aa的丝氨酸肽酶功能域能够特异水解人流感病毒或低致病性禽流感病毒HA0，从而成熟的HA1、HA2发挥作用使病毒基因组释放入细胞内，加速病毒多周期生长，但同时外加的胰酶也加大细胞培养的难度，提高了疫苗生产成本。
技术实现思路
本专利技术第一方面，提供了一种稳定分泌表达牛胰蛋白酶原的修饰的Vero细胞系，该细胞系含有整合入其细胞基因组的完整的分泌型牛胰蛋白酶原S.pro-try的编码基因。在一个具体实施方式中，所述细胞基因组含有分泌型牛胰蛋白酶原编码基因，核苷酸序列(GenbankLOC780933)具体如SEQIDNo.1所示：ATGAAGACCTTCATCTTTCTGGCTCTCTTGGGAGCCGCTGTTGCTTTCCCCGTGGACGATGATGACAAGATCGTGGGCGGCTACACCTGTGGGGCAAATACTGTCCCCTACCAAGTGTCCCTGAACTCTGGCTACCACTTCTGCGGGGGCTCCCTCATCAACAGCCAGTGGGTGGTGTCTGCGGCTCACTGCTACAAGTCCGGAATCCAAGTGCGTCTGGGAGAAGACAACATTAATGTCGTTGAGGGCAATGAGCAATTCATCAGCGCATCCAAGAGTATCGTCCATCCCAGCTACAACTCAAACACCTTAAACAACGACATCATGCTGATTAAACTGAAATCAGCTGCCAGTCTCAACAGCCGAGTAGCCTCTATCTCTCTGCCAACATCCTGTGCCTCTGCTGGCACCCAGTGTCTCATCTCTGGCTGGGGCAACACCAAAAGCAGTGGCACCAGCTACCCTGATGTCCTGAAGTGTCTGAAGGCTCCCATCCTATCAGACAGCTCTTGCAAAAGTGCCTACCCAGGCCAGATCACCAGCAACATGTTCTGTGCGGGCTACCTGGAGGGCGGAAAGGACTCCTGCCAGGGTGACTCCGGTGGCCCTGTGGTCTGCAGTGGAAAGCTCCAGGGCATTGTCTCCTGGGGCTCTGGCTGCGCTCAGAAAAACAAGCCTGGTGTCTACACCAAGGTCTGCAACTACGTGAGCTGGATTAAGCAGACCATCGCCTCCAACTAA(SEQIDNo.1)。在一个具体实施方式中，所述细胞系命名为VTY55，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.12680，保藏日期为2016年7月6日。本专利技术第二方面，提供一种构建上述修饰的Vero细胞系的方法，所述方法包括将编码S.pro-try的开放阅读框cDNA序列与真核表达载体连接，再将所述真核表达载体转染到Vero细胞系中，经抗生素加压筛选获得稳定表达的细胞系。在一个具体实施方式中，所述真核表达载体是pcDNA3.1。在一个具体实施方式中，将目的序列与真核表达载体连接，并瞬时转染入Vero细胞系中。在一个优选的实施方式中，将分泌型牛胰蛋白酶原的真核表达载体连续加压筛选，结合有限稀释法获得稳定表达单克隆细胞。更优选的，所述连续加压筛选是在高浓度的G418条件下筛选。更进一步，所述G418的浓度为600μg/ml。优选的，所述分泌型牛胰蛋白酶原的核酸编码序列如SEQIDNo.1所示。更优选的，所述修饰的Vero细胞系为VTY55，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.12680，保藏日期为2016年7月6日。本专利技术第三方面，提供一种上述修饰的Vero细胞系的应用，其中，所述应用包括将上述修饰的Vero细胞系用于培养流感病毒，制备流感疫苗，抗流感药物筛选，中和抗体测定或者流感其他相关研究等领域的应用。优选的，所述流感为人流感。本专利技术的第四方面，提供一种培养流感病毒的方法，其中，所述方法包括利用上述修饰的Vero细胞系对流感病毒进行培养。在一个具体实施方式中，上述方法中的流感为人流感。在一个具体实施方式中，上述方法包括，将人流感病毒H1、H3亚型及B型毒株接种于本专利技术构建的上述的修饰的Vero细胞系中。在一个具体实施方式中，上述方法包括，病毒在所述细胞上的培养条件为37℃、4％CO2、无血清培养48-72h，收获病毒上清液即得流感病毒液。优选的，所述方法中的增殖人流感病毒的步骤中不需要添加TPCK-胰酶。优选的，所述方法中的增殖人流感病毒的步骤中也可以进一步添加TPCK-胰酶。本专利技术的第五方面，提供一种制备流感疫苗的方法，其中，所述方法包括利用上述修饰的Vero细胞系来制备流感疫苗。在一个具体实施方式中，上述方法中的流感为人流感。在一个具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达分泌型牛胰蛋白酶原的修饰的Vero细胞系，其特征在于，所述细胞系含有整合入其细胞基因组的完整的分泌型牛胰蛋白酶原S.pro‑try的编码基因。

【技术特征摘要】
1.一种表达分泌型牛胰蛋白酶原的修饰的Vero细胞系，其特征在于，所述细胞系含有整合入其细胞基因组的完整的分泌型牛胰蛋白酶原S.pro-try的编码基因。2.如权利要求1所述的细胞系，其特征在于，在所述编码S.pro-try的基因序列前加入Kozak序列。3.如权利要求2所述的细胞系，其特征在于，所述编码S.pro-try的基因序列如SEQIDNo.1所示。4.如权利要求1-3任一项所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为VTY55，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12680。5.一种构建如权利要求1-4中任一项所述的细胞系的方法，所述方法包括将编码S.pro-try的开放阅读框cDNA序列与真核表达载体连接，再将所述真核表达载体转染到Vero细胞系中，经抗生素加压筛选获得稳...

【专利技术属性】
技术研发人员：江征，朱秀娟，李长贵，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11