本发明专利技术涉及一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌为黑曲霉（Aspergillus?niger），该基因工程菌株包含α-葡萄糖转苷酶基因表达盒。本发明专利技术基因工程菌不仅能高效表达α-葡萄糖转苷酶，而且调高了α-葡萄糖转苷酶的分泌效率。同时，α-葡萄糖转苷酶分泌到胞外，降低了对α-葡萄糖转苷酶提取纯化的成本，节约了工业用料，降低了生产成本，具有明显的社会效益。而且，菌株经发酵后获得的粗酶液的酶活力比出发菌株酶活力提高了4.0~12.1倍，为α-葡萄糖转苷酶在食品工业中的应用及工业化生产奠定了基础，也打破了α-葡萄糖转苷酶依赖于进口的瓶颈，具有巨大的经济效益和社会效益，具有广阔市场开发前景。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌为黑曲霉（Aspergillus?niger），该基因工程菌株包含α-葡萄糖转苷酶基因表达盒。本专利技术基因工程菌不仅能高效表达α-葡萄糖转苷酶，而且调高了α-葡萄糖转苷酶的分泌效率。同时，α-葡萄糖转苷酶分泌到胞外，降低了对α-葡萄糖转苷酶提取纯化的成本，节约了工业用料，降低了生产成本，具有明显的社会效益。而且，菌株经发酵后获得的粗酶液的酶活力比出发菌株酶活力提高了4.0~12.1倍，为α-葡萄糖转苷酶在食品工业中的应用及工业化生产奠定了基础，也打破了α-葡萄糖转苷酶依赖于进口的瓶颈，具有巨大的经济效益和社会效益，具有广阔市场开发前景。【专利说明】高效表达Cl-葡萄糖转苷酶的基因工程菌及其构建方法
本专利技术属于基因工程
，涉及基因工程菌株及其构建方法，尤其是一种高效表达a-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株及其构建方法。
技术介绍
a -葡萄糖转苷酶(a -transglucosidase, EC 2.4.1.24),又称 a -葡萄糖苷酶、 转移葡萄糖苷酶，它可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开a-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基转移到另一个糖类底物形成a-1，6糖苷键，从而得到非发酵性的功能低聚异麦芽糖(頂O)、糖脂或糖肽等。a-葡萄糖转苷酶是一种重要的工业用酶， 在食品、饲料、化工、医药等领域显示了广阔的应用前景，特别是在MO生产中的巨大应用潜力早已引起国内外食品工业界的重视。目前，我国还没有规模化生产a-葡萄糖转苷酶的能力，工业上所用的a-葡萄糖转苷酶主要依赖于进口，价格昂贵。国内关于a-葡萄糖转苷酶的研究也主要集中于产a -葡萄糖转苷酶菌株的筛选、诱变及培养条件优化等方面，效果均不太理想，诱变株的稳定性较差，酶产量还是偏低，并且难以纯化。近几年来，随着基因工程技术的迅猛发展， 构建和利用基因工程菌作为大规模生产a -葡萄糖转苷酶的宿主，进一步提高酶活及酶的产量，降低生产成本，成为研究该酶制剂的一种新途径，并在世界范围内得到越来越广泛的重视及应用。1997年，Akira N等从黑曲霉工业菌株GN-3中克隆出a -葡萄糖转苷酶基因，并将该基因引入到Emericella nidulans中表达,表达量为0.96 U/mg蛋白。1999年, Galichet A等从Thermococcus hydrothermal is AL662菌株中，通过建立基因文库，克隆了 a-葡萄糖转苷酶基因，将该基因克隆到Sulfolobus solfataricus突变株TCY70中，但其表达量较低。2001年，Martino A等以硫磺矿硫化叶菌MT-4总DNA为模板，通过PCR将 a-葡萄糖转苷酶基因克隆到E.coli中表达，其表达量达到87.5 U/g湿菌体。2004年，苏艳利用大肠杆菌表达系统表达黑曲霉a -葡萄糖转苷酶基因，经IPTG诱导，酶活高达226.8 U/mL。2008年，杨捷琳等从阪崎肠杆菌中克隆a -葡萄糖苷酶基因，重组到pET22b ( + )质粒在大肠杆菌中进行表达及活性研究，目标蛋白量约占菌体总蛋白量的18%。2009年，童星等以毕赤酵母KM71为宿主菌表达黑曲霉SG136 a-葡萄糖转苷酶基因，并对表达产物的转苷活性进行测定，制备的粗酶液在最适PH和温度下反应24 h时，低聚异麦芽糖的总含量达到最大为26.0%。我国关于a-葡萄糖转苷酶的研究起步较晚，为了改变依赖于进口这一现状，寻求一条国产化的道路，本专利技术利用基因工程技术构建基因工程菌株，进一步提高酶的产量及活性，为其工业化生产奠定基础。通过检索，尚未发现.与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种增加了 a -葡萄糖转苷酶基因的拷贝数，有效提高了酶的表达量，为其工业化生产奠定了基础的高效表达α -葡萄糖转苷酶的基因工程菌及其构建方法，该构建方法易于操作、方法简单，而且可以构建含有不同基因拷贝数和在基因组位置不同的工程菌。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的:一种高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌为黑曲霉(Aspergillus niger)，该基因工程菌株包含α -葡萄糖转苷酶基因表达盒。而且，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶基因的来源为黑曲霉。而且，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中含有糖化酶启动子、糖化酶信号肽、α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因和色氨酸终止子。而且，所述α-葡萄糖转苷酶基因表达盒中的α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因的N-末端融合了糖化酶信号肽。如上所述的高效表达α -葡萄糖转苷酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下:⑴根据GenBank中已报道的糖化酶启动子序列为依据，设计引物，以黑曲霉基因组DNA为模板扩增糖化酶启动子序列；⑵根据GenBank中已报道的α -葡萄糖转苷酶mRNA序列、糖化酶信号肽序列为依据，设计引物，以黑曲霉总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到含有糖化酶信号肽的α _葡萄糖转苷酶的成熟肽基因；⑶根据GenBank中已报道的色氨酸终止子序列为依据，设计引物，以质粒pBI_hph为模板扩增得到色氨酸终止子序列；⑷将步骤⑴中糖化酶启动子序列、步骤⑵中α -葡萄糖转苷酶成熟肽基因和步骤⑶中色氨酸终止子序列经酶切后依次与载体PT-Z连接，构建完整的α -葡萄糖转苷酶基因表达盒，随后将其插入到pB1-hph的Hind III和Xba I位点之间，鉴定正确后，获得双元载体为 pB1-Glu ；(5)双元载体pB1-Glu转化到农杆菌LBA4404中，利用农杆菌阳性克隆子对黑曲霉进行介导转化，构建基因工程菌，黑曲霉转化子经鉴定正确后，测定黑曲霉转化子的产α -葡萄糖转苷酶的活力，筛选产酶活力比出发菌株活力提高了 4.(12.1倍的菌株即得高效表达α-葡萄糖转苷酶的基因工程菌。而且，所述步骤⑷的具体步骤为:糖化酶启动子序列的PCR产物经Kpn I与Nco I酶切后，切胶回收该启动子片段，插入经连接酶连接pUCm-T质粒后形成的闭合环状的pT-Z质粒的Kpn I与Nco I位点之间，获得重组质粒ρΤ_Ρ ；PCR扩增的色氨酸终止子序列电泳回收后，用Xba I与BgI II进行酶切回收并连接到同样酶切的PT-P质粒的相应位点上，获得重组质粒pT-P-C ；把连接到T载体上含有糖化酶信号肽的α-葡萄糖转苷酶成熟肽基因利用BgI II与Nco I酶切并电泳回收后，插入到pT-P-C质粒的BgI II与Nco I位点之间，获得重组质粒 pT-P-a -C ；质粒pT-P- a -C经Hind ΙΙΙ/Xba I双酶切，获得α -葡萄糖转苷酶基因表达盒，将该基因片段插入质粒pB1-hph的Hind III和Xba I位点之间，构建双元载体pB1-Glu。而且，所述高效表达a -葡萄糖转苷酶的基因工程菌经发酵所测粗酶液酶活力比出发菌株酶活力提高了 12.1倍。本专利技术的优点和积极效果如下:1、本专利技术基因工程菌不仅能高效表达a -葡萄糖转苷酶，而且提高了 a -葡萄糖转苷酶的分泌效率。同时，a -葡萄糖转苷酶分泌到胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效表达α?葡萄糖转苷酶的基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株的宿主菌为黑曲霉（Aspergillus?niger），该基因工程菌株包含α?葡萄糖转苷酶基因表达盒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黎明，路福平，刘萌，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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