本发明专利技术公开了一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，包括下述步骤：（1）愈伤诱导；（2）愈伤组织预培养；（3）菌种活化与培养；（4）侵染；（5）共培养；（6）延迟选择；（7）诱导不定芽；（8）伸长培养；（9）诱导生根及检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。本发明专利技术的方法克服了现有技术因以杨树茎段或叶柄为外植体的杂交杨农杆菌转化方法后期染菌而被迫不断继代的缺点，可以用少量愈伤组织外植体快速获得的抗性转基因杨树，周期短、染菌率低、转化效率高，为大规模的转基因杨树提供了一种技术手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
技术介绍
杨属Populus L.在全世界约有100多种，广泛分布于欧亚和北美洲。我国约有62种，是世界杨树种质资源最多的国家。杨属植物因其生长快、适应性强、用途广泛，不仅在水土保持和维护生态平衡方面发挥重要作用，而且还具有广泛的工业用途，是制浆造纸、胶合板、包装材料等的重要原料。长期以来，杨树的改良主要通过杂交育种的方式进行，但因其生长发育受光照、水分、温度很多因素影响，与其它农作物和园艺植物比较，有许多特有的生物学特性，如较长的生长周期、复杂的生殖方式、高度杂合性等，使得传统的杨树育种方法己远远不能满足现代育种的要求，所以，利用组织培养技术和基因工程方法来满足实践中对杨树育种的要求具有重要的意义。进入二十世纪八十年代后，随着分子生物学理论和技术的快速发展，以1983年首株转基因烟草问世为标志，功能基因的克隆和转基因技术己广泛应用到植物抗性的研究领域。尽管以木本植物为实验材料的林木基因工程因研究难度较大，进展相对滞后，但是由于杨树生长速度快，易繁殖，核基因组(约420Mb)及染色体数目相对较小，易于通过农杆菌转化，使得杨树成为研究树木分子生物学、林业生物技术及树木基因组的模式植物。目前，在植物上应用的遗传转化方法主要有DNA直接转移法和根癌农杆菌(Agrobactenium tumefaciens)介导法。其中后者最为常用，是目前应用最广泛且结果较为理想、技术较为成熟的一种基因转化方法。它具有操作简便，外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝，整合位点稳定，转移DNA片段明确，整合后外源基因结构变异小，可转移大片段DNA，可直接用不同的植物组织进行基因转移等优点。已被应用于双子叶植物的遗传转化研究，现有的转基因植物如烟草拟南芥西红柿玉米等，80%以上是通过这种方法获得的。随着对杨属的遗传转化研究的逐渐深入，农杆菌侵染已经应用于胡杨、欧洲黑杨、毛果杨、小叶杨等树种，但对白杨派及其杂种无性系的研究较为滞后，转化效率较低；而白杨派树种具有适应生境广、抗逆性强、乡土树种多、种间杂交能力强、能在大陆半干旱带和大陆湿润带等广泛生境范围内栽培并可发挥较大的生产作用等独特优势，因此研究一种针对白杨派的高效转基因方法对林木分子育种意义深远。目前白杨派中农杆菌介导的转基因的方法多局限于叶片和叶柄，而直接侵染这些外植体周期长转化效率低，而且后期染菌严重，因此本研究以白杨杂种无性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)为实验对象,建立了一种以愈伤组织为受体的杂交杨农杆菌转化方法。注:本研究采用的农杆菌为C58/pMP90/pH7GWIWG2⑴，C58具有利福平抗性，辅助Ti质粒pMP90具有庆大霉素抗性；通过Gateway技术构建的表达载体pH7GWIWG2 (I)具有壮观霉素抗性，其T-DNA上的潮霉素磷酸转移酶基因作为转基因杨树的选择标记基因，编码蛋白具有潮霉素抗性。具有潮霉素抗性的再生苗用特异性引物进行全基因组PCR检测，产物大小为456bp,验证目的片段转入白杨杂种无性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)中。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种以愈伤组织为外植体的农杆菌转化白杨杂种无性系方法。本专利技术的技术方案概述如下:，包括下述步骤:(I)愈伤诱导:将白杨杂种无性系717-1B4 (P.tremulaXP.alba)的腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4-6周获得组培苗；切取所述组培苗0.8-1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2-3次造成伤口或切取所述组培苗的带有0.1-0.5cm2叶片的叶柄置于Ml’固体培养基中，于24-26°C黑暗条件下预培养12-15天；更换一次Ml’固体培养基，继续在24-26°C黑暗条件下预培养12-15天，有愈伤组织生成；(2)愈伤组织预培养:将步骤(I)获得的愈伤组织切成0.4-0.6cm3的块，置于Ml固体培养基预配养2_3天;(3)菌种活化与培养:用移液枪枪头挑取_80°C保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27-29°C倒置暗培养20-28h ;挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27-29°C倒置暗培养36-48h ；挑取单菌落至2_4mL含有抗生素的YEB液体培养基的无菌试管中，150-200rpm27-29°C暗培养12_16h ;吸取0.1-1.0mL菌液放置于50_75mL含有抗生素的YEB液体培养基的锥形瓶中，150-200rpm27-29°C暗培养至菌液OD6tltl=0.6-0.8 ；(4)侵染:将步骤(3)获得的菌液在室温、3500-4000rpm离心10_15min，弃去上清液，将沉淀用50-75mL M液重悬，得到侵染液，按30-50个/25mL的比例将经步骤(2)预培养的愈伤组织放入所述侵染液中，24-26°C条件下80-100rpm侵染10_20min ；(5)共培养:取出侵染后的愈伤组织，吸干表面残留的侵染液，放在Ml固体培养基上，24-26°C，暗条件下培养24-36小时；(6)延迟选择:取出步骤(5)培养的愈伤组织，弃掉因侵染而褐变的愈伤组织，先用去离子水在180-220rpm下洗涤4_5min，洗涤2_3次，再用浓度为350_500mg/L的头孢霉素-去离子水溶液150-200rpm洗涤4_5min，洗涤2_3次，吸干表面水分并转移至CM固体选择培养基中，24-26°C于黑暗条件下培养3-5天，舍弃与CIM固体选择培养基的接触处可见白色农杆菌菌落的愈伤组织，将剩余愈伤组织转移到新鲜的CIM固体选择培养基中，500-800Lux弱光下培养5-8天；(7)诱导不定芽: 将步骤(6)获得的愈伤组织转移至SMa固体培养基中，22-26°C 1500-2000Lux,光照周期为光照/黑暗16h/8h的条件下进行培养，得到表面为白色或白色略带褐化的愈伤组织，每14-21天更换一次SIMa固体培养基；待白色或白色略带褐化的愈伤组织表面出现绿色的愈伤组织，用解剖刀剥离绿色的愈伤组织转移至新鲜SIMa固体培养基中22-260C 1500-2000Lux光照条件下培养，待绿色愈伤组织表面开始长出玻璃化的不定芽；将带有玻璃化不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb固体培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至l_2cm ；(8)伸长培养:切取不定芽转移至含有SEM固体培养基的组培瓶中24_26°C 1500_2000LuX光照条件下培养2-4周，获得表型趋于正常的芽；(9)诱导生根及检测:取步骤(8)获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM固体培养基中，24-260C 1500-2000Lux光照下诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。基本培养基的组成为:MS盐2.2g，蔗糖20_30g，琼脂7-7.2g，定容至1L，ρΗ5.6-5.8 ；Ml’固体培养基的组成为:MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素 2ipl.02mg,琼脂 7-7.2g，定容至 1L，pH=5.6-5.8。Ml固体培养基的组成为:MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征包括下述步骤：?（1）愈伤诱导：?将717杨树的腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4?6周获得组培苗；切取所述组培苗0.8?1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2?3次造成伤口或切取所述组培苗的带有0.1?0.5cm2叶片的叶柄置于M1“固体培养基中，于24?26℃黑暗条件下预培养12?15天；更换一次M1“固体培养基，继续在24?26℃黑暗条件下预培养12?15天，有愈伤组织生成；?（2）愈伤组织预培养：?将步骤（1）获得的愈伤组织切成0.4?0.6cm3的块，置于M1固体培养基预配养2?3天；?（3）菌种活化与培养：?用移液枪枪头挑取?80℃保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27?29℃倒置暗培养20?28h；挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27?29℃倒置暗培养36?48h；?挑取单菌落至2?4mL含有抗生素的YEB液体培养基的无菌试管中，150?200rpm27?29℃暗培养12?16h；吸取0.1?1.0mL菌液放置于50?75mL含有抗生素的YEB液体培养基的锥形瓶中，150?200rpm27?29℃暗培养至菌液OD600=0.6?0.8；?（4）侵染：?将步骤（3）获得的菌液在室温、3500?4000rpm离心10?15min，弃去上清液，将沉淀用50?75mL?M液重悬，得到侵染液，按30?50个/25mL的比例将经步骤（2）预培养的愈伤组织放入所述侵染液中，24?26℃条件下80?100rpm侵染10?20min；?（5）共培养：?取出侵染后的愈伤组织，吸干表面残留的侵染液，放在M1固体培养基上，24?26℃，暗条件下培养24?36小时；?（6）延迟选择：?取出步骤（5）培养的愈伤组织，弃掉因侵染而褐变的愈伤组织，先用去离子水在180?220rpm下洗涤4?5min，洗涤2?3次，再用浓度为350?500mg/L的头孢霉素?去离子水溶液150?200rpm洗涤4?5min，洗涤2?3次，吸干表面水分并转移至CIM固体选择培养基中，24?26℃于黑暗条件下培养3?5天，舍弃与CIM固体选择培养基的接触处可见白色农杆菌菌落的愈伤组织，将剩余愈伤组织转移到新鲜的CIM固体选择培养基中，500?800Lux弱光下培养5?8天；?（7）诱导不定芽：?将步骤（6）获得的愈伤组织转移至SIMa固体培养基中，22?26℃1500?2000Lux，光照周期为光照/黑暗16h/8h的条件下进行培养，得到表面为白色或白色略带褐化的愈伤组织，每?14?21天更换一次SIMa固体培养基；待白色或白色略带褐化的愈伤组织表面出现绿色的愈伤组织，用解剖刀剥离绿色的愈伤组织转移至新鲜SIMa固体培养基中22?26℃1500?2000Lux光照条件下培养，待绿色愈伤组织表面开始长出玻璃化的不定芽；将带有玻璃化不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb固体培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至1?2cm；?（8）伸长培养：?切取不定芽转移至含有SEM固体培养基的组培瓶中24?26℃1500?2000Lux光照条件下培养2?4周，获得表型趋于正常的芽；?（9）诱导生根及检测：?取步骤（8）获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM固体培养基中，24?26℃1500?2000Lux光照下诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王洁华，昝艳君，籍燕，魏志蓉，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：
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