用于寄生体控制的植物miRNA的过表达制造技术

本发明专利技术提供了用于产生一种对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞的方法，这些方法包括：将一种异源miR164核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中表达，由此产生一种相对于对照的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞。本发明专利技术进一步提供了在大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，以及提供了包括用于转化植物、植物部分或植物细胞的核酸构建体的组合物以及经转化的植物、植物部分与植物细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过植物miRNA过表达而进行的植物寄生体以及病原体的控制，尤其是用于控制线虫寄生体的方法。背景植物寄生体(有害生物与病原体)每年引起全球数十亿美元的作物损失。线虫(尤其是大豆胞囊线虫)是第一位的大豆有害生物。线虫是专性定栖的体内寄生体，其以超过2000种植物的根、叶以及茎，果实，以及观赏植物为食，引起全球大约I千亿美元的作物损失。线虫存在于美国各地，但是在南部以及西部的温暖潮湿地区以及在沙壤土中是一个主要的问题。1954年在北卡罗来纳州首次发现了大豆胞囊线虫(SCN, Heterodera glycines)。它是大豆植物最严重的有害生物。一旦SCN存在于大田里，使用已知的方法不能将其可行地根除。尽管大豆是受SCN袭击的主要经济作物，但是SCN还在总共大约五十中宿主上寄生，包括大田作物、蔬菜、观赏植物以及杂草。线虫损害的征兆包括叶发育不良以及黄化，以及在炎热时节植物的萎蔫。然而，线虫(包括SCN)可以引起严重的产量损失，但没有明显的地上症状。植物感染SCN可以I)导致矮化的或发育不良的根，2)减少这些根上的固氮根瘤的数目，并且3)使得这些根更易受其他土壤生植物有害生物的袭击。SCN的生命周期由卵阶段、四幼年阶段以及成虫阶段组成。在卵中第一次蜕皮之后，SCN第二阶段幼体(J2)孵化，移动穿过土壤，穿透根并向维管柱移动。J2是线虫可以感染大豆根的唯一生命阶段。移动的幼体在皮层、内皮层、或中柱鞘中选择宿主细胞并且诱发宿主细胞融合为一种永久取食部位(称作合胞体)的构造的一部分。在此时，线虫变为定居并且分化为第三(J3)以及第四(J4)幼年阶段并且然后成熟为成年雌性或雄性。因此活跃摄食的线虫从植物窃取必须营养，从而导致产量损失。随着线虫取食，它们膨大并且最终雌性线虫变得如此之大以至于它们破坏穿过根组织并且暴露在根的表面。雄性线虫(它们不随着成年而膨大)经历变态在J4阶段恢复蠕虫状形态并且向回移行出根以使成年雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍旧附着于根系统并且继续摄食。受精之后，雌性产卵，多数卵仍留在体内。死亡之后，雌性躯体发展为一种包裹这些卵的硬化胞囊胞囊最终驱除出去并且被发现游离在土壤中。胞囊的外壁变得十分坚硬，如此为包含在其中的200-400个卵提供了保护。SCN卵在胞囊中存活直到合适的孵化条件发生。尽管这些卵中有许多可以在第一年之内孵化，但是有许多将在这些胞囊中存活数年。常规的用于管理SCN的惯例包括:在SCN感染的土地中维持适当的地力以及土壤PH水平；控制其他植物疾病以及昆虫与杂草有害生物；使用卫生惯例，比如仅在耕种未感染田地之后进行SCN感染的田地的耕地、栽植以及栽培；在受感染田地中耕种之后彻底清洁设备；不使用来自受感染土地上生长的植物的种子用于种植未感染田地，除非该种子已经经过适当清洁；轮转受感染的田地并且用非宿主作物(比如玉米、燕麦以及苜蓿)轮换宿主作物；使用杀有害生物剂或熏蒸剂(例如杀线虫剂);以及种植抗性大豆品种。虽然这些惯例中有许多是有效的，但是除了实施耗费时间并且昂贵之外，这些方法中有一些不再可行，比如施用杀线虫剂，这是由于它们的毒性以及负面环境影响。如此，目前没有有效率并且有效的方法来控制植物中的线虫感染。因此，对于用于预防、控制以及减少植物中的线虫寄生的组合物以及方法存在需要。因此，本专利技术通过提供包括微小RNA (miRNA)的、用于控制植物寄生体(尤其是线虫有害生物)的组合物与方法而克服了现有技术的缺陷。专利技术概述本专利技术的一个方面是用于产生一种对植物寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分或植物细胞的方法，该方法包括将一种异源微小RNA164 (miR164)核苷酸序列引入该植物、植物部分或植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物、植物部分或植物细胞中表达，由此产生一种相对于对照植物、植物部分或植物细胞对植物寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部 分或细胞。本专利技术的另一个方面提供了用于产生一种对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞的方法，该方法包括:将一种异源微小RNA164 (miR164)核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物、植物部分和/或植物细胞中表达，由此产生一种相对于对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞。本专利技术的一个另外的方面提供了一种用于在大豆植物或其部分中增加对大豆胞囊线虫寄生的抗性的方法，该方法包括:a)将一种异源miR164核苷酸序列引入一种大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该大豆植物细胞中表达；并且b)从(a)的大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物或其部分，其中该转基因大豆植物或其部分在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性。本专利技术的另一个方面提供了一种用于在大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，该方法包括:将一种异源miR164核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中表达，由此相对于对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞在大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成。在一个另外的方面，本专利技术提供了一种用于减少大豆植物或其部分中的大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，该方法包括a)将一种异源miR164核苷酸序列引入一种大豆植物细胞，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物细胞中表达；并且b)从(a)的大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物或其部分，其中该转基因大豆植物或其部分在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。本专利技术的另外的方面提供了包括用于转化植物、植物部分和/或植物细胞的核酸构建体的组合物，并且提供了经转化的植物、植物部分和/或其植物细胞。本专利技术的这些以及其他方面将在以下的本专利技术的描述中更详细地说明。附图简述附附图说明图1展示了大豆gma_MIR164序列(前体序列)。从该前体加工而来的成熟miRNAgma-miR164序列加了下划线。附图2A-B 展示了表达载体 15312prCMP-miR164-tN0S (附图 2A)以及B-15312-prAR6-c⑶S-tNOS (附·图2B)。prCMP是香树属病毒启动子(参见例如美国专利号7，166，770)；prAR6拟南芥属属根启动子(参见例如美国专利号7，615，624)；tN0S是来自根瘤农杆菌的nos基因的终止子；并且cGUS是一个β-葡萄糖苷酸酶报告基因。附图3是显示了 gma_miR164的过表达对大豆胞囊线虫(SCN)胞囊形成的影响的数据图。附图4是显示了 miR396b的过表达对转基因的毛状根上的胞囊发展的影响的图。专利技术详细说明本说明不意在是一个本专利技术以其而实施的所有不同方式，或可以加入本专利技术中的所有特征的详细目录。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄翔，K塞吉恩，
申请(专利权)人：先正达参股股份有限公司，
类型：
国别省市：