本发明专利技术属于植物基因工程领域，公开了一种提高薄荷挥发油主要成分含量的载体pCAMBIA2301-CaMV35S-MhLS。该载体是含有薄荷柠檬烯合酶(limonene?synthase)基因MhLS的植物过量表达载体。本发明专利技术首次从国产薄荷品种738中克隆得到MhLS基因全长编码序列，利用农杆菌介导法遗传转化薄荷，通过该基因在薄荷挥发油合成途径中的过量表达，促进薄荷醇和薄荷酮的合成，提高薄荷挥发油中主要成分的含量。由本发明专利技术的表达载体转化获得的薄荷新品质，其后代薄荷油中单萜成分的含量提高，对薄荷品种的遗传改良中具有很大的应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程领域，涉及薄荷柠檬烯合酶基因MhLS及其植物过量表达载体的具体构建方法和应用。
技术介绍
薄荷属植物不仅是全世界重要的药用植物之一，也是仅次于橘类的第二大香料植物。薄荷油是薄荷的主要化学成分，在食品、制药、香料、化妆品工业上具有大量用途。单萜是薄荷挥发油主要成分。单萜是由两个异戊二烯结构单元组成的ClO类萜类化合物及其衍生物。单萜类化合物在抵抗微生物病原菌、防御昆虫和植食性动物方面有着重要的作用，在吸引昆虫传粉和植物种群竞争中也很重要(Pichersky and Gershenzon,2002)。薄荷挥发油合成途径被视为是植物单職合成途径的典型模式(Jonathan et al.,2000)。挥发油最主要的成分薄荷脑的形成需要经过很多步反应，包括一系列不同类型的生化反应(Kjonaas and Croteau, 1983 ；Kjonaas et al., 1985 ；Croteau andVenkatachalam,1986)。同时，催化每个反应的酶也都已经被阐明(Kjonaas et al., 1982,1985 ；CroteauandVenkatachalam,1986 ；Karp et al.，1990 ；Croteau et al.，1991 ；Alonso et al.，1992 ；Rajaonarivony et al.，1992 ；Colby et al.，1993)。柠檬烯是最简单的环形单萜，广泛存在于植物挥发油中，如薄荷属、柑橘属、松科、伞形科植物等(Guenther, 1972)。在薄荷中,朽1檬烯是薄荷挥发油合成前提，不论在是薄荷酮化学型薄荷或在香芹酮化学型薄荷。柠檬烯合酶催化GPP环化为柠檬烯(Kjonas andCroteau, 1983),该反应决定薄荷油合成途径的整体反应速率(Gershenzon and Croteau,1991)。柠檬烯合酶是最典型的被子植物单萜环化酶。该酶大小为65 kDa，pI值大约为5.0，最佳反应pH为7.0左右。柠檬烯合酶需要与二价金属离子(如Mg2+或Mn2+)才能与底物结合并催化反应。此酶可以识别香叶基作为它的底物，还对半胱氨酸残基、甲硫氨酸残基、组氨基酸残基等较为敏感(David et al.，2007)。农杆菌介导法是应用最广泛的植物遗传转化方法。将薄荷柠檬烯合酶基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导法进行植物遗传转化，可以获得单萜含量提高的新种质。对于薄荷新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供薄荷单萜合成途径中的关键调控酶-柠檬烯合酶的基因序列，使得可以对薄荷单萜合成途径进行调控和改造，提高目的产物的产量。本专利技术同时提供了该基因的植物过量表达载体及其构建方法。所构建的植物表达载体可以用于农杆菌介导的遗传转化，创造新的薄荷品质资源，可用于薄荷品种改良。附图说明图1薄荷MhLS基因的PCR扩增结果图2薄荷MhLS基因植物表达载体构建双酶切过程图3重组菌液PCR检测结果图4重组质粒酶切验证具体实施方式实施例1薄荷柠檬烯合酶基因的克隆从GenBank中查找柠檬烯合酶基因的cDNA序列，并设计引物序列如下:上游引物5 ’ -GAAAGAGAGCGGAAGGAAAGATT下游引物5 ’ -AGAATTACGTACGAACTATGCCTT以薄荷第一链cDNA为模版扩增，得到MhLS基因的全长cDNA序列。取IOOmg植物组织于液氮中仔细研磨，直至呈粉末状；快速转移样品至1.5mlRNase free离心管中，加入Iml的裂解液PL颠倒混匀，在65°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解；4°C的条件下12，OOOrpm离心10分钟,小心取上清转入一个新的RNase free过滤柱中；收集下滤液(含有总RNA)于收集管中；在收集管中加入I倍体积70%乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)；得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)；10，OOOrpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管；加入500μ I去蛋白液RE，12，OOOrpm离心45秒，弃掉废液；加入700 μ I漂洗液Rff, 12，OOOrpm离心60秒，弃掉废液；加入500 μ I漂洗液RW，12，OOOrpm离心60秒，弃掉废液；将吸附柱RA放回空收集管中，12，OOOrpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加50 μ IRNase freewater,室温放置2分钟，12, OOOrpm离心I分钟。在RNase-free的PCR管中加入以下试剂:RNA 2μ g ；01igo dT-Adaptor Primer (100 μ M/μ I) I μ I ;dNTP (IOmM) I μ I ;以 H20DEPC 补足至14 μ I。在PCR上进行:65°C，5min，后置于冰上急冷；在上述混合液中，加入以下反转录反应液:RNase Inhibitor (40U/ μ I) I μ I ；5 XFirst-Strand Buffer 5 μ I ；M-MLV 逆转录酶(200υ/μ 1)1μ I ； H2ODEPC 4μ I总共为25 μ I。在PCR仪上按以下条件进行cDNA第一条链的合成反应:30°C IOmin ；42°C 90min ；72°C 5min。将反转录产物稀释用于PCR反应模板。 将cDNA100ng、10XBuffer2.5μ 1、dNTP (IOmM) 0.5 μ 1、MgC12(25mM) 1.5 μ 1、上游引物(10μΜ)1μ 1、下游引物(10μΜ)1μ 1、ExTaq (5U/μ I) 0.1μ I 及 ddWater 共 20 μ I 混合物在PCR仪上进行以下反应94°C 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 2min共35个循环；72°C IOmin ；4°C Imin终止反应。扩增产物用I %的琼脂糖凝胶(含I % EB)，在I X TAE电泳缓冲液中，IlOV恒压电泳30分钟，检测目的片段。将检测到的目的条带用手术刀片切割下来，并使用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒进行回收。将回收产物进行PMD19-T Vector (TaKaRaBiotechnology (Dalian) C0.，Ltd.，China)连接，反应体系参照 pMD19_T Vector 说明书。16°C进行连接数个小时。将5 μ I连接产物加到装有50 μ I感受态细胞(DH5 α )的1.5ml离心管中，轻轻敲打混匀，冰浴30min，42°C热激90sec，迅速置于冰上并冰浴lOmin。加入950 μ I灭菌的液体LB培养基，37°C恒温培养1.5h。吸取200 μ I菌液混合X_gal (20mg/ml)和IPTG(200mg/ml)涂布含100mg/ml氨苄的LB固体培养基，37°C恒温倒置培养12_16h。每个平板挑取10个白色克隆，移入装有Iml灭菌灭菌的液体LB培养基(含有100mg/ml氨苄)的1.5ml离心管中，37°C，240rpm培本文档来自技高网...
【技术保护点】
薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的植物过量表达载体pCAMBIA2301?CaMV35S?MhLS，该载体包含薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的完整编码序列及卡那霉素筛选标记基因nPtII和植物组成型启动子CaMV35S。
【技术特征摘要】
1.薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的植物过量表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S-MhLS，该载体包含薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的完整编码序列及卡那霉素筛选标记基因nPtll和植物组成型启动子CaMV35S。2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于MhLS基因序列来源于薄荷(M.haplocalyx Briq.)，GenBank 登录号为 JX555976。3.薄荷柠檬烯合酶基因MhLS的遗传转化体系，其特征在于: 1)将之前培养好的无菌苗，取2 4节茎段按茎节切段，将长度在0.5cm-l.0cm的节间茎段平...
【专利技术属性】
技术研发人员：李维林，王海棠，梁呈元，于盱，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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