【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种利用水杨酸或水杨酸和钙离子促进伯克霍尔德氏菌合成毒黄素的方法。
技术介绍
1、伯克霍尔德氏菌（ burkholderia）在工业和农业上具有多种用途。部分伯克霍尔德氏菌可合成一种小分子抗菌物质——毒黄素。毒黄素已被证实对多种肿瘤细胞具有良好的抑制活性，其抗真菌活性良好，特别是对可耐受唑类药物的烟曲霉突变株和新生隐球菌也具有抑制活性。作为一种具有良好生物活性的小分子物质，人们尝试了各种方法合成毒黄素。目前主要采用化学合成的方法生产毒黄素，但是化学合成方法在技术上较为复杂且费时，且使用的有机试剂较多，易污染环境，加上得率较低，造成生产成本较高，限制了毒黄素及其衍生物的应用。
2、生物合成具有绿色环保、成本低等优点。但是，自然界分离到的微生物合成毒黄素的能力普遍较低，发酵24 h只有20 mg/l左右的产量（levenberg b, linton sn. on thebiosynthesis of toxoflavin, an azapteridine antibiotic produced by pseudomonas cocovenenans. j biol chem, 1966, 241: 846-852）。所以，目前利用生物合成的方法合成毒黄素还无法实现。
3、此外，还有研究发现对毒黄素进行结构修饰后，获得的一些类似物被证实具有良好的活
4、本专利技术所涉及的伯克霍尔德氏菌（拉丁文分类命名为 burkholderia sp.）hdxy-02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（china generalmicrobiological culture collection center, cgmcc），保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为 2017年4月20日，所述菌株的登记入册编号为cgmcc no. 14054。
5、伯克霍尔德氏菌hdxy-02具有高产毒黄素的特性，进一步提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02毒黄素产量和毒黄素相对合成量成为毒黄素生物合成函待解决的问题。
6、微生物次级代谢物合成是一种依赖于生长阶段，可由代谢物、营养等其它环境信号诱导产生的细胞反应，特定物质可影响微生物次级代谢物的合成。不同细菌次级代谢物的合成会受到特殊的诱导物等因素的影响。通过检索，发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献：一种利用信号分子促进伯克霍尔德氏菌合成毒黄素的方法（202010723120.x），该专利通过在发酵培养基中添加一氧化氮供体或一氧化氮和kcl提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02产量和毒黄素相对合成量。缺点是由于这种促进作用主要依赖于no气体分子，而气体分子在短时间内释放后无法持续刺激毒黄素合成，活性作用时较短，而kcl等盐离子的添加会抑制细菌的生长，因此需要发掘更加高效稳定、作用时间更长的诱导物。
7、本专利技术旨在寻找能够长效并显著提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02毒黄素合成的诱导物，延长活性作用时间，增强活性功效。为进一步提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02的毒黄素产量和毒黄素相对合成量提供依据。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种利用水杨酸促进保藏编号为cgmcc no. 14054的伯克霍尔德氏菌hdxy-02毒黄素合成的方法，能够长时间提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02的毒黄素产量和毒黄素相对合成量。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案。
3、在培养基中添加水杨酸促进伯克霍尔德氏菌hdxy-02毒黄素合成的方法：取活化的伯克霍尔德氏菌hdxy-02接入新鲜的lb液体培养基中，种子液30℃震荡培养过夜（14-18h），取过夜培养物按照1%的接种量接种至基本培养基（kmb培养基）中，同时加入水杨酸。
4、所述的培养基中水杨酸的终浓度为0.1 mm ~ 5 mm。
5、所述提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02毒黄素产量和合成能力的水杨酸在培养基中的浓度，优选地终浓度为 0.5 mm。
6、所述培养温度为30℃，培养时间为2-4天。
7、本专利技术发现，与对照相比，采用本专利技术在发酵培养基中加入水杨酸的方法可有效提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02的毒黄素合成能力和产量。
8、更进一步地，本专利技术发现将水杨酸和钙离子组合添加时，伯克霍尔德氏菌hdxy-02的毒黄素合成能力会比单独添加水杨酸或钙离子时更高，呈现出叠加效应。尤其当同时添加水杨酸（0.5 mm）和氯化钙（50 mm）时，3 d后可提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02的毒黄素合成能力至未处理的3.18倍，发酵上清液中毒黄素含量最高可达未处理的2.44倍；4 d后可提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02的毒黄素合成能力至未处理的3.09倍，发酵上清液中毒黄素含量最高可达未处理的2.68倍。本专利技术提高了伯克霍尔德氏菌hdxy-02生产毒黄素的产量和单位菌体合成能力，且作用持续时间较长，可降低毒黄素单位生产成本，提高采用微生物发酵法合成毒黄素的可行性。
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1. 一种利用水杨酸或水杨酸与CaCl2复合添加提高伯克霍尔德氏菌HDXY-02发酵上清液中毒黄素含量和单位菌体毒黄素相对产量OD393/OD600的方法，其特征在于，所述分类命名为伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）的菌株HDXY-02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC），保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为 2017年4月20日，所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 14054。
2.权利要求1中所述利用水杨酸或水杨酸与CaCl2复合添加提高伯克霍尔德氏菌HDXY-02发酵上清液中毒黄素含量和单位菌体毒黄素相对产量OD393/OD600的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，水杨酸用0.22 μm的滤膜除菌后加入所述培养基中，CaCl2母液通过高压灭菌后，培养基中水杨酸终浓度为0.1 mM~5 mM，CaC
4. 根据权利要求2所述液液萃取的方法，其特征在于，测定发酵液OD600后，将发酵液8000 r/min离心10 min除去菌体，加入等体积的氯仿萃取三次，收集有机相，挥发后用80%甲醇溶液重悬，检测393 nm处吸光值，计算出发酵上清液中毒黄素含量和单位菌体毒黄素相对产量OD393/OD600。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，同时添加水杨酸和CaCl2在培养基中的终浓度分别为0.5 mM、50 mM。
6.权利要求1所述利用水杨酸或水杨酸与CaCl2添加提高伯克霍尔德氏菌HDXY-02发酵上清液中毒黄素含量和单位菌体毒黄素相对产量OD393/OD600的方法在发酵生产毒黄素产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1. 一种利用水杨酸或水杨酸与cacl2复合添加提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02发酵上清液中毒黄素含量和单位菌体毒黄素相对产量od393/od600的方法，其特征在于，所述分类命名为伯克霍尔德氏菌（burkholderia sp.）的菌株hdxy-02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（china general microbiological culture collection center,cgmcc），保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为 2017年4月20日，所述菌株的登记入册编号为cgmcc no. 14054。
2.权利要求1中所述利用水杨酸或水杨酸与cacl2复合添加提高伯克霍尔德氏菌hdxy-02发酵上清液中毒黄素含量和单位菌体毒黄素相对产量od393/od600的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晓丹，汪仁，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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