【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及大曲微生物总rna指纹图谱、构建方法及其应用。
技术介绍
1、“曲乃酒之母”，大曲是白酒酿造过程的重要糖化发酵生香剂，对白酒中风味的形成至关重要，大曲的品质直接决定了白酒的产量与质量，而决定大曲品质的物质主要是大曲中的微生物，大曲中的微生物主要包括细菌、霉菌与酵母菌，其中细菌是产香的主要动力，霉菌主要起糖化作用，酵母菌具有酒化以及产酯能力。因此，大曲微生物群落多样性及演替性一直是研究的热点。
2、近年来，随着免培养技术，比如dna序列同源分析、pcr-dgge，克隆文库，二代测序等的广泛应用，对大曲微生物群落多样性和结构的认识已经相对清晰。尽管这些基因测序方法得到的研究结果极大地丰富了人们对大曲微生物群落物种多样性的认知，但基于dna的方法可以检测到死亡或休眠状态细胞的dna，却不能准确反映大曲中微生物的生理或转录活性及其功能。研究表明，分别采用基于dna和rna方法分析的环境微生物群落结构存在较大差异，同时宏转录组测序技术能更为准确地揭示环境微生物功能及代谢途径。
3、关于大曲活性微生物群落及其功能变化的研究报道匮乏问题，急需开发大曲微生物宏转录组分析及rna指纹图谱的构建方法，并将其应用于准确揭示大曲活性微生物功能及重要风味物质代谢合成途径，对于大曲重要风味物质的产生机理的研究及提高大曲品质具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有报道中对于大曲宏转录组研究较少的技术问题，本专利技术提供一种大曲微生物总rna指纹图谱、构建
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供大曲微生物总rna指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
4、a、大曲总rna的提取：将大曲粉置于裂解液中，离心，吸取上清液；然后加入有机溶剂洗涤，洗涤后得大曲总rna；
5、其中，所述大曲粉种类为酱香型大曲、浓香型大曲、清香型大曲、兼香型大曲中至少一种。
6、优选地，所述浓香型大曲为包包曲。
7、其中，所述大曲粉是采用液氮研磨10～30s的方式制备而成，大曲粉的直径＜0.1mm。
8、其中，所述裂解液组成包括：苯酚0.8～1mol/l、异硫氰酸胍0.6～0.8mol/l、乙烯糖四乙酸0.01～0.05mol/l、乙基苯基聚乙二醇0.3～0.8％、β-硫基乙醇0.008～0.03mol/l、硼酸钠0.1～0.5mol/l。
9、优选地，所述裂解液组成包括：苯酚1mol/l、异硫氰酸胍0.8mol/l、乙烯糖四乙酸0.03mol/l、乙基苯基聚乙二醇0.5％、β-硫基乙醇0.01mol/l、硼酸钠0.2mol/l。
10、其中，所述有机溶剂洗涤是依次加入无水乙醇、异丙醇、75％乙醇离心后弃上清液进行洗涤，所述无水乙醇、异丙醇、75％乙醇的加入量均为100～500μl/次。
11、其中，所述离心速率均为10000～15000rpm，离心时间为1～3min。
12、b、样品检测与质控：对步骤a中的大曲总rna进行浓度和质量测定，浓度≥0.1ng/μl，rna总量≥0.1μg，a260/a280在1.8-2.2之间即为合格；
13、c、对步骤b中质控合格样品进行rna打断、cdna合成、末端修复、接头连接、文库检测；
14、其中，所述rna打断条件为：94～95℃，5～10min。
15、其中，所述cdna合成是向打断后的rna中加入第一链合成反应液进行反应合成一链cdna；再加入第二链合成反应液进行反应合成二链cdna。
16、优选地，所述第一链cdna合成反应液包括：片段mrna(fragmented mrna)、链特异性受体(strand specificity reagent)、第一链酶混合物(1st strand enzyme mix)，体积比为(15～19)：(4～8)：2；反应条件为：23～25℃下反应5～10min，40～42℃反应12～15min，68～70℃反应15～20min；
17、所述第二链cdna合成反应液包括：第一链cdna(1st strand cdna)，第二链缓冲液(2nd strand buffer)，第二链酶主混合物(2nd strand enzyme master mix)，体积比为(3～5)：(4～6)：1；反应条件为14～16℃反应20～30min，69～72℃反应12～15min。
18、其中，所述末端修复是修复双链cdna末端，并在3’末端加上a碱基，修复反应液包括：第一链cdna(1st strand cdna)，第二链缓冲液含dntp(2nd strand buffer dntp)，第二链酶主混合物(2nd strand enzyme master mix)，体积比为(3～5)：(4～6)：1；反应条件为14～16℃反应20～30min，69～72℃反应12～15min。
19、其中，所述接头连接反应液包括：有a碱基尾的dna(da-tailed dna)，连接增强剂(ligation enhancer)，新型t4 dna连接酶(novel t4 dna ligase)，dna适配器(dnaadapter)，体积比为：(12～13)：(5～6)：1：1，反应条件为：18～20℃反应10～15min。
20、其中，所述文库检测是将构建好的文库通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价。
21、d、对步骤c中处理后的样品进行环化制备与测序；
22、其中，所述环化反应是将接头连接后的pcr产物变性为单链后，再进行环化反应，得到单链环形产物，消化掉未被环化的线性dna分子。
23、优选地，所述环化反应液包括：2×superii high-fidelity mix，primermix for mgi 5，适配器连接dna(adapter ligated dna)，体积比为(4～5)：1：4，反应条件为98℃1min，98℃10s，60℃30s，72℃30s，15个循环；72℃5min。
24、其中，所述测序是将单链环状dna分子通过滚环复制，形成一个包含多个拷贝的dna纳米球(dnb)，将得到的dnbs采用高密度dna纳米芯片技术，加到芯片上的网状小孔内，通过联合探针锚定聚合技术(cpas)进行测序；
25、e、对原始测序数据过滤杂质，获得高质量数据，包括以下至少一项处理：
26、(1)剔除含有≤10％ n碱基的reads(短片段序列)；
27、(2)剔除含有15个碱基及以上区域比对到接头序列的reads；
28、(3)剔除含有40％以上的q<20的低质量碱基的reads；
29、(4)去除比对上宿主基因组的序列；对于宿主环境来源的样品，为了降低宿主序列对后续分析的干扰，需去除比对上宿本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.大曲微生物总RNA指纹图谱的构建方法，其特征在于：基于宏转录组分析方法构建，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述大曲粉种类为酱香型大曲、浓香型大曲、清香型大曲或兼香型大曲中至少一种；优选地，所述浓香型大曲为包包曲。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：步骤a中，所述裂解液组成包括：苯酚0.8～1mol/L、异硫氰酸胍0.6～0.8mol/L、乙烯糖四乙酸0.01～0.05mol/L、乙基苯基聚乙二醇0.3～0.8％、β-硫基乙醇0.008～0.03mol/L、硼酸钠0.1～0.5mol/L；和/或
4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于：步骤c中，所述RNA打断条件为：94～95℃，5～10min；和/或
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤c中，
6.根据权利要求1～5任一项所述的构建方法，其特征在于：步骤c中，
7.根据权利要求1～6任一项所述的构建方法，其特征在于：步骤d中，
8.根据权利要求1～7任一项所述的构建
9.权利要求1～8任一项所述构建方法构建获得的大曲微生物总RNA指纹图谱。
10.权利要求1～8任一项所述的构建方法或权利要求9所述的指纹图谱在大曲活性微生物功能、代谢途径分析、大曲发酵过程功能基因差异表达上的应用。
...【技术特征摘要】
1.大曲微生物总rna指纹图谱的构建方法，其特征在于：基于宏转录组分析方法构建，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述大曲粉种类为酱香型大曲、浓香型大曲、清香型大曲或兼香型大曲中至少一种；优选地，所述浓香型大曲为包包曲。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：步骤a中，所述裂解液组成包括：苯酚0.8～1mol/l、异硫氰酸胍0.6～0.8mol/l、乙烯糖四乙酸0.01～0.05mol/l、乙基苯基聚乙二醇0.3～0.8％、β-硫基乙醇0.008～0.03mol/l、硼酸钠0.1～0.5mol/l；和/或
4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗青春，赵鑫锐，卢彦坪，李江华，苏建，陈坚，郑佳，赵东，
申请(专利权)人：宜宾五粮液股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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