一种利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，是提高喜树碱新型药源植物短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法。从长春花中克隆异胡豆苷合成酶和香叶醇-10-羟化酶基因的编码框序列，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌介导法遗传转化短小蛇根草获得转CrSTR和CrG10H基因的短小蛇根草毛状根；利用植物激素诱导处理高产喜树碱株系，获得了喜树碱含量为4.703mg/g?DW的高产毛状根。MTT检测证明，通过转基因方式获得的喜树碱粗提物具有良好的生物活性，肿瘤细胞杀伤力达35.9%。本发明专利技术为获取喜树碱提供了一种新型药源，也为生产具重要临床需求的抗癌药物喜树碱提供了一种新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，特别是一种利用基因共转化策略获提高短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法，为商业化生产抗癌药物喜树碱提供一种新型药源原料制备方法。
技术介绍
喜树碱(Comptothecin, CPT )是一种喹啉类生物碱，是一类最初从喜树(Camptotheca acuminata)中提取出的天然抗癌药物,喜树碱类药物具有高效低毒和广谱抗癌等诸多优点，是目前最有效的天然抗癌药物之一，并且其抗癌机理非常独特，是迄今为止发现的唯一一种通过抑制拓扑异构酶I发挥细胞毒性的天然植物活性成分，喜树碱及衍生物与紫杉醇、维生素甲类化合物抗肿瘤作用的发现被誉为“20世纪90年代抗癌药物的三大发现”。目前已有多种喜树碱衍生物类药物如依立替康(Irinotecan)和拓扑替康(Topotecan)获得了美国食品药物管理局(F DA)认证，在临床上被广泛用于治疗卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌以及白血病等多种恶性肿瘤，全球市场需求十分巨大。目前世界上喜树碱类药物的生产主要是从喜树等植株中提取，然而由于喜树天然资源数量有限，生长十分缓慢，喜树碱及其类似物在植物体内含量又非常低，且提取环节多、费时费力，所以从天然喜树中提取喜树碱的方法已远远不能满足人们对喜树碱日益增长的需求。人们十分渴望能寻找到产喜树碱的新资源，如生长快速的草本植物，来作为研究喜树碱生物合成及其分子调控机制的模式系统和生药替代来源。短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)为菌草科蛇根草属植物,全草药用，性味苦寒，有清热解毒之功效，民间常用全草治疗外伤感染及肿毒等症。更重要的是，早在1976年人们就发现了这种草本植物能产生天然抗癌物质喜树碱及其衍生物(Tafur et al.，1976)。但令人遗憾的是，直到最近几年人们才开始意识到蛇根草属植物所具有的巨大药用价值和商业开发潜力。由于短小蛇根草作为一种产喜树碱的草本植物比木本植物喜树具有更多的研究优势如生长快周期短，易于遗传转化及植株再生等，所以，短小蛇根草是一种开展喜树碱生物合成的分子调控和代谢工程研究的优良材料。多年来，国内外学者围绕着扩大喜树碱药源问题进行了诸多领域的研究如化学全合成，半合成及细胞培养等，并取得了一定的进展。喜树碱的化学全合成虽然已经成功，但因成本太高、产量太低、周期太长且易造成环境污染等因素而限制了其商业化生产；半合成方法虽然是目前最有效的途径之一，但其前体的提取分离仍然依赖于天然资源的供应；细胞悬浮培养则存在喜树碱含量低微及稳定性较差等问题同样难以实现工业化生产(Hengelet all992)。相比之下，利用基因工程技术将喜树碱生物合成途径中的关键酶基因导入产喜树碱的资源植物中，继而获得转基因的发根系或再生植株等，并进行大规模的培养是实现从根本上提高喜树碱含量的最佳途径之一(Lorence and Nessler2004, Lu et al2008)。研究表明喜树碱生物合成途径中的两个前体物质色胺(tryptamine)和裂环马钱子苷(secologanin)分别由上游途径:莽草酸途径(Shikimate Pathway)/卩引哚途径(Indole Pathway)和 MEP(2_C_ 甲基-D-赤藓糖醇 _4_ 憐酸)途径提供(Yamazaki etal2004、Carolis et all994、唐中华 et al2003)。在卩引哚途径中分支酸(chorismate)在邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthase, AS)催化下形成邻氨基苯甲酸(anthranilate)。邻氨基苯甲酸再经多步反应得到色氨酸(tryptophan),色氨酸在色氨酸脱羧酶(tryptophan decarbosylase, TDC)的催化作用下形成色胺。在MEP途径中的香叶醇-10-羟化酶(GlOH)是关键限速酶，该酶催化香叶醇形成10-羟基香叶醇，再经多步反应形成下游产物——裂环马钱子苷；异胡豆苷合成酶(STR)是催化色胺和裂环马钱子苷合成吲哚类生物碱共同前体——异胡豆苷(Strictosidine)的关键酶。来自莽草酸途径的色胺和裂环马钱子苷在STR的催化下形成异胡豆苷，该步反应是整个萜类吲哚生物碱合成的中心反应。异胡豆苷在异胡豆苷β-D-糖苷酶(Strictosidine β -D-glucosidase, SGD)作用下转化成直夹竹桃唳苷(Strictosamide)后,再经过多步反应最终生成喜树碱。目前，由直夹竹桃啶苷到喜树碱的下游合成途径尚未明了，仅检测到个别中间产物如山松醇苷/短小蛇根草苷(3-S-Pumi1side)和脱氧山松醇苷(3-S_Deoxypumi1side)(关水 et al2004、王磊et al2008)。采用基因工程手段将上述的两个关键酶基因STR和GlOH来共同转化产喜树碱的植物短小蛇根草，将有可能打破喜树碱生物合成途径的瓶颈效应，获得高产喜树碱的短小蛇根草毛状根或者再生植株，为商业化生产喜树碱和羟基喜树碱提供新型优质药源。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高产喜树碱的新型草本药源植物短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法。本专利技术利用已克隆的长春花CrSTR和CrGlOH基因，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌(如C58C1等)为介导，将CrSTR和CrGlOH基因同时导入短小蛇根草茎段中并再生出毛状根；PCR和荧光定量PCR检测目的基因CrSTR和CrGlOH的整合和表达情况，高效液相色谱测定短小蛇根草转基因毛状根中喜树碱含量。技术方案为:一种用于提高喜树碱含量的重组载体，含有异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-羟化酶基因CrGlOH。关键酶基因CrSTR和GlOH双基因共转化提高喜树碱含量的方法，包括如下具体步骤:(1)将异胡豆苷合成酶基因(CrSTR 基因，SEQ ID N0.1，GenBank:X53602.1)和香叶醇-10-羟化酶基因(CrGlOH基因，SEQ ID N0.2, GenBank:AJ251269.1)插入植物表达载体，构建重组载体；以长春花幼苗RNA为模板PCR获得CrSTR和CrGlOH基因片段；植物表达载体可选用pCAMBIA质粒或pBI质粒，尤其是pCAMBIA1304质粒；(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；发根农杆菌可选用发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株L BA9402 ；(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化短小蛇根草，优选为短小蛇根草茎段，获得毛状根；(4)检测步骤(3)毛状根中的CrSTR和CrGlOH基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；(5)利用植物激素对获得的转基因毛状根进行诱导，使其喜树碱含量进一步提高。所述的植物激素为茉莉酸、脱落酸、水杨酸或二甲基亚砜。将步骤(4)筛选得到的毛状根液体培养35 45天后，用浓度为80 200 μ M水杨酸或二甲基亚砜诱导转基因毛状根3 7天，或者用浓度为80 200 μ M的茉莉酸或脱落酸诱导转基因毛状根7天。毛状根的液体培养液中，喜树碱含量有很大提高。优选的,步骤(4)中的检测方法为PCR及本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇?10?羟化酶基因CrG10H插入植物表达载体，构建重组载体；(2)将步骤（1）所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化短小蛇根草，获得毛状根；(4)检测步骤（3）毛状根中的CrSTR和CrG10H基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；(5)利用植物激素对获得的转基因毛状根进行诱导，使其喜树碱含量进一步提高。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：滕小娟，开国银，季倩，时敏，崔丽洁，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：