一种喜树碱新型药源原料的制备方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，是提高喜树碱新型药源植物短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法。从长春花中克隆出CrORCA3和CrG10H基因的编码框序列，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌介导法遗传转化短小蛇根草获得转CrORCA3和CrG10H基因的短小蛇根草毛状根。获得的转基因短小蛇根草毛状根中喜树碱含量显著提高，平均每瓶喜树碱产量（2.62mg/flask）比对照增加了5.52倍，平均含量（8.44mg/g?DW）提高4.04倍。其中一个株系培养6周后经植物激素诱导后每瓶的喜树碱总产量提高7.8倍。本发明专利技术为生产具重要临床需求的抗癌药物喜树碱提供了一种新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物工程
，特别是提高一种喜树碱新型药源原料短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法，为商业化生产抗癌药物喜树碱提供一种新型药源原料制备方法。
技术介绍
喜树碱(Comptothecin, CPT )是一种喹啉类生物碱，是一类最初从喜树(Camptotheca acuminata)中提取出的天然抗癌药物,喜树碱类药物具有高效低毒和广谱抗癌等诸多优点，是目前最有效的天然抗癌药物之一，并且其抗癌机理非常独特，是迄今为止发现的唯一一种通过抑制拓扑异构酶I发挥细胞毒性的天然植物活性成分，喜树碱及衍生物与紫杉醇、维生素甲类化合物抗肿瘤作用的发现被誉为“20世纪90年代抗癌药物的三大发现”。目前已有多种喜树碱衍生物类药物如依立替康(Irinotecan)和拓扑替康(Topotecan)获得了美国食品药物管理局(FDA)认证，在临床上被广泛用于治疗卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌以及白血病等多种恶性肿瘤，全球市场需求十分巨大。目前世界上喜树碱类药物的生产主要是从喜树等植株中提取，然而由于喜树天然资源数量有限，生长十分缓慢，喜树碱及其类似物在植物体内含量又非常低，且提取环节多、费时费力，所以从天然喜树中提取喜树碱的方法已远远不能满足人们对喜树碱日益增长的需求。人们十分渴望能寻找到产喜树碱的新资源如生长快速的草本植物，来作为研究喜树碱生物合成及其分子调控机制的模式系统和生药替代来源。短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)为菌草科蛇根草属植物，全草药用，性味苦寒，有清热解毒之功效，民间常用全草治疗外伤感染及肿毒等症。更重要的是，早在1976年人们就发现了这种草本植物能产生天然抗癌物质喜树碱及其衍生物(Tafur et al.，1976)。但令人遗憾的是，直到最近几年人们才开始意识到蛇根草属植物所具有的巨大药用价值和商业开发潜力。由于短小蛇根草作为一种产喜树碱的草本植物比木本植物喜树具有更多的研究优势如生长快周期短，易于遗传转化及植株再生等，所以，短小蛇根草是一种开展喜树碱生物合成的分子调控和代谢工程研究的优良材料。多年来，国内外学者围绕着扩大喜树碱药源问题进行了诸多领域的研究如化学全合成，半合成及细胞培养等，并取得了一定的进展。喜树碱的化学全合成虽然已经成功，但因成本太高、产量太低、周期太长且易造成环境污染等因素而限制了其商业化生产；半合成方法虽然是目前最有效的途径之一，但其前体的提取分离仍然依赖于天然资源的供应；细胞悬浮培养则存在喜树碱含量低微及稳定性较差等问题同样难以实现工业化生产(Hengelet all992)。相比之下，利用基因工程技术将喜树碱生物合成途径中的关键酶基因导入产喜树碱的资源植物中，继而获得转基因的发根系或再生植株等，并进行大规模的培养是实现从根本上提高喜树碱含量的最佳途径之一(Lorence and Nessler2004, Lu et al2008)。大量研究表明，异胡豆苷合成酶(STR)，色氨酸脱羧酶(Tryptophandecarboxylase, TDC),香叶醇-10-轻化酶(GeraniollO-hydroxylase, G10H)及 1-脱氧木酮糖 _5_ 憐酸合成酶(l-Deoxy-D-Xylulose5_Phosphate Synthase, DXS)等关键酶在包括喜树碱在内的TIAs的生物合成中具有重要作用(Canel et all998 ；De Luca et all989 ；Lopez-Meyer1997 ；Yamazaki et al2003 ；McKnight et all990 ；Kutchanl989 ；Yamazaki etal2003 ；Lu et al2008)。另外，近年来转录因子正逐渐被认为是一种能有效地调控植物次生代谢途径的新手段。通过超量表达转录因子，能够有效地克服多基因共转化存在的弊端，全面上调能被其调控的相关基因的表达水平，对整个次生代谢途径的调控效果要比单纯依赖单个(或多个)结构基因的增强表达好得多。例如van der Fits和Memelink (2000)在SCIENCE上报道发现一个受茉莉酸甲酯诱导并能够调控植物初级和次生代谢的中央转录调控因子 0RCA3 (Octadecanoie-responsive Cantharanthus AP2_domain protein3),能增强TIAs生物合成代谢途径中绝大多数催化酶基因的协同表达，从而有效地调控长春花(Catharanthus roseus)中TIAs的生物合成,充分展示了用转录调节因子来调控TIAs生物合成的巨大潜力。0RCA3的发现为调控喜树碱的代谢合成提供了一种新的研究切入点。必须指出的是转录因子并非万能的，单转化一个0RCA3基因，虽然可以调控诸如AS，TDC，DXS，CPR和STR等多个关键酶基因的协同表达，但是有些基因如关键酶基因GlOH并不受0RCA3的调控。在0RCA3基因过量表达的细胞中由于关键酶基因GlOH的表达不足，从而限制了 TIA代谢终产物如长春碱的产量没有得到显著提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服常规技术中的不足，提供，可有效提高短小蛇根草毛状根中喜树碱含量。本专利技术还提供了实现上述方法的重组载体。本专利技术利用已克隆的长春花Cr0RCA3和CrGlOH基因，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌(如C58C1等)为介导，将Cr0RCA3和CrGlOH基因同时导入短小蛇根草茎段中并再生出毛状根；PCR和荧光定量PCR检测目的基因Cr0RCA3和CrGlOH的整合和表达情况，高效液相色谱测定短小蛇根草转基因毛状根中喜树碱含量。技术方案为:，用转录因子0RCA3和关键酶GlOH双基因共转化提高喜树碱含量，包括如下具体步骤:(I)将转录因子基因(Cr0RCA3 基因，SEQ ID N0.1，GenBank:EU072424.1)和香叶醇-10-羟化酶基因(CrGlOH基因，SEQ ID N0.2,GenBank:AJ251269.1)插入植物表达载体，构建重组载体；以长春花幼苗RNA为模板PCR获得Cr0RCA3和CrGlOH基因片段；植物表达载体可选用pCAMBIA质粒或pBI质粒，尤其是pCAMBIA1304质粒；(2)将步骤(I)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；发根农杆菌可选用发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株L BA9402 ；(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化短小蛇根草，优选为短小蛇根草的茎段，获得毛状根；(4)检 测步骤(3)毛状根中的Cr0RCA3和CrGlOH基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；检测方法为PCR 及 Southern blotting 检测。PCR阳性的转基因毛状根克隆进行Southern blot检测，证明目的基因Cr0RCA3和CrGlOH已整合到短小蛇根草毛状根基因组中；荧光定量PCR测定Cr0RCA3和CrGlOH在短小蛇根草转基因毛状根中的表达情况；高效液相色谱法测定短小蛇根草转基因毛状根中喜树碱含量，进一步筛选喜树碱和羟基喜树碱含量显著提高的短小蛇根草转基因毛状根株系。所述的PCR检测中，分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种喜树碱新型药源原料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将转录因子基因CrORCA3和关键酶香叶醇?10?羟化酶基因CrG10H插入植物表达载体，构建重组载体；（2）将步骤（1）所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；（3）利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化短小蛇根草，获得毛状根；（4）检测步骤(3)毛状根中的CrORCA3和CrG10H基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆。（5）利用植物激素对获得的转基因毛状根进行诱导，使其喜树碱含量进一步提高。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：滕小娟，开国银，李姗姗，郝小龙，崔丽洁，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：