具有降低的木聚糖含量的转基因树制造技术

本发明专利技术涉及用于产生与相同物种的野生型树相比具有降低的木聚糖含量的转基因树的方法，所述方法包括降低所述转基因树中来自糖基转移酶43(GT43)家族的一种或更多种基因的表达，从而改善所述转基因树的生长特性、机械特性和/或糖化特性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及改善树特性的领域。具体地，本专利技术涉及下调木聚糖生物合成机构中的糖基转移酶43基因，同时增强生长特性、改善糖化特性和机械特性的方法。本专利技术还涉及所使用的表达载体、转基因树和木材。这样的树和木材可用于植树造林和生物能源用途。
技术介绍
作为可再生生物燃料的丰富原材料，木材是优良的能源。高等植物的细胞壁包含多糖，例如纤维素、半纤维素、果胶和多酚化合物如木质素(lignin)。所有这些细胞壁组分构成木素纤维素生物质(lignocellulosic)，其为能量的丰富来源。木聚糖是硬木(hardwood)中的主要半纤维素，构成木质生物质的约20％。对于一个物种，硬木中木聚糖主链的长度通常在窄长度范围内，但是可以根据分离工艺变化。残基的数目在50和250之间变化。据推测，硬木中木聚糖的长度被严格控制。木聚糖由大量糖基转移酶(GT)在高尔基体中合成并且在小泡内转运至质膜，在那里它们被整合到细胞壁中并与其他壁组分交联。在杨属(Populus)中，糖基转移酶属于基因家族GT8、GT43和GT47。它们是木聚糖主链的起始、延伸和终止所需的。自从在拟南芥属(Arabidopsis)中发现参与木聚糖生物合成的第一个基因以来，木聚糖的生物合成便成为深入研究的领域。毛果杨(Populustrichocarpa)GT43组包括被称作GT43A至GT43G的7种基因。核酸序列示为SEQIDNO：1至7；并且相应的氨基酸序列示为SEQIDNO：8至14。对毛果杨、拟南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)的比较性序列分析表明GT43基因形成三个不同的进化枝，它们在三个相异的属中是保守的，见图1。拟南芥核酸序列在序列表中示为：SEQIDNO：15(AtlRX9，进化枝I)、SEQIDNO：16(AtlRX9-L，进化枝II)、SEQIDNO：17(AtlRX14，进化枝III)和SEQIDNO：18(AtlRX14-L，进化枝III)。相应的氨基酸序列分别示为SEQIDNO：19至22。低等维管植物和云杉仅有进化枝II和进化枝III两个进化枝。研究已显示，进化枝I或II的成员以及进化枝III的成员为木聚糖木糖基转移酶活性所需。这被最近的研究(Lee等(2012)PlantSignaling&Behavior7：1-6)所支持，其表明两种杨树糖基转移酶PtrGT43B和PtrGT43C参与木聚糖生物合成。他们的发现表明，在木聚糖主链生物合成期间，杨属GT43成员协同作用以催化木糖基残基的连续转移。这进一步支持以下假说：GT43基因家族成员的生化功能在维管植物中是进化保守的。已经发现杨属GT43成员参与木聚糖主链的延伸。GT43A和GT43B在木材形成期间被高度表达，特别是在正在进行次生细胞壁增厚的细胞中表达。已经通过RNAi降低了转基因的杨属中杨属GT43B基因的表达(Lee等(2011)Mol.Plant4：730-747)。这种降低的表达导致这些杨属转录物降低至WT水平的2％-15％。结果，形成在纤维和脉管中具有薄细胞壁和不规则木质部表型(萎缩的脉管)的异常木质部。此外，这些株系(line)中木糖含量降低至WT木糖含量的50％至80％。S-木质素和G-木质素的含量也降低。戊糖(如木聚糖)被视为差的发酵底物，因此木聚糖含量的降低在发酵应用中是有益的。然而，具有降低的木聚糖含量的植物矮小，和/或产生具有萎缩的和薄的细胞壁的木质部。这样的植物也是瘦弱的并且具有脆弱的茎。当通过RNAi降低GT43B基因的表达时，木质素含量降低(Lee等(2011)Mol.Plant4：730-747)。当对相同量的纤维素进行酶消化时，GT43BRNAi、GT47CRNAi株系中纤维素的可消化性与WT相比提高。没有提供关于每干重木素纤维素的之糖化产量的信息。具有木聚糖缺陷的一些杨树株系瘦弱并且具有脆弱的茎(Li等(2011)TreePhysiol.31：226-236)。这些树的生长在GT47C抑制的情况下不受影响，这在其他转基因株系的情况下未见报道。WOs2012/103555描述了通过反义下调拟南芥属中的IRX9基因导致降低的木聚糖含量以及降低的生长特性和降低的机械特性。US2012/0185975公开了来自拟南芥属糖基转移酶基因的分离启动子。据论述，其可以用于植物、植物部分或植物细胞以用于胁迫处理。木聚糖含量的降低将导致木材中纤维素的比例增加。已知与源自纤维素的糖相比，源自木聚糖的糖被视为差的发酵底物，因此木聚糖含量的降低将是有益的。基于以上论述，关于具有降低的木聚糖含量的树的问题是：其是矮小的，和/或产生具有萎缩的和/或薄的细胞壁的木质部。这样的树也是瘦弱的并且具有脆弱的茎。因此需要产生具有增强的生长以及保持的或改善的机械特性的转基因树的方法和工具。此外，需要更好的糖化特性。这种转基因树构成了用于一般用途的植树造林和用于特别用途的生物能源作物的有价值原料。
技术实现思路
第一方面，本专利技术提供了用于产生转基因树的方法，所述转基因树与相同物种的野生型树相比具有降低的木聚糖含量，所述方法包括降低所述转基因树中来自糖基转移酶43(GT43)家族的一种或更多种基因的表达，其中所述转基因树与相同物种的野生型树相比具有增强的生长特性和改善的机械特性和/或糖化特性。在一个实施方案中，根据此方面的方法包括以下步骤：(a)将表达载体导入树细胞，所述表达载体包含：(i)至少一个启动子；(ii)有效连接在所述启动子下游的第一核苷酸序列，其包含来自GT43家族的一种或更多种基因；和(iii)有效连接在所述第一核苷酸序列下游的与所述第一核苷酸序列互补的第二核苷酸序列；其中所述连接的核苷酸序列在细胞中被转录成RNA，从而产生发夹RNA，所述发夹RNA在细胞中被加工成为能够降低来自GT43家族的一种或更多种基因的表达的干扰RNA分子；以及(b)将步骤(a)的所述树细胞培养成转基因树，并且无性繁殖所述转基因树以获得转基因树株系。从获得的大量株系、优选地不少于20个株系中选择特别在发育中木材(developingwood)中GT43基因表达降低的转基因树株系。在一个优选的实施方案中，所述启动子为木材特异性启动子，其在次生壁生物合成期间上调。在另一个优选的实施方案中，所述木材特异性启动子选自GT43启动子；次生壁CesA启动子；RWA启动子，尤其是与拟南芥属RWA1、RWA3或RWA4启动子同源的启动本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生转基因树的方法，所述转基因树与相同物种的野生型树相比具有降低的木聚糖含量，所述方法包括降低所述转基因树中来自糖基转移酶43(GT43)家族的一种或更多种基因的表达，其中所述转基因树与相同物种的野生型树相比具有增强的生长特性和改善的机械特性和/或糖化特性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.21 SE 1351248-81.一种用于产生转基因树的方法，所述转基因树与相同物种的野生型树相比具有降低
的木聚糖含量，所述方法包括降低所述转基因树中来自糖基转移酶43(GT43)家族的一种或
更多种基因的表达，其中所述转基因树与相同物种的野生型树相比具有增强的生长特性和
改善的机械特性和/或糖化特性。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：
(a)将表达载体导入树细胞，所述表达载体包含：
(i)至少一个启动子；
(ii)有效连接在所述启动子下游的第一核苷酸序列，其包含来自GT43家族的一种或更
多种基因；和
(iii)有效连接在所述第一核苷酸序列下游的与所述第一核苷酸序列互补的第二核苷
酸序列；
其中所连接的核苷酸序列在所述细胞中转录成RNA，从而产生发夹RNA，所述发夹RNA在
所述细胞中被加工成能够降低来自GT43家族的一种或更多种基因的表达的干扰RNA分子；
以及
(b)将步骤(a)中的所述树细胞培养成转基因树。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述启动子为木材特异性启动子，其在次生壁生物
合成期间上调。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述木材特异性启动子选自：GT43启动子；次生壁
CesA启动子；RWA启动子，尤其是与拟南芥属RWA1、RWA3或RWA4启动子同源的启动子；与拟南
芥属IRX10启动子同源的启动子；GUX1或GUX2启动子；AtFRA8、AtIRX8/或AtPARVUS启动子；
AtXyn1启动子；AtTBL29启动子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述木材特异性启动子为包含SEQIDNO：25所示
之核苷酸序列的GT43B启动子，或者包含SEQIDNO：23所示之核苷酸序列的GT43B来源的WP
启动子。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在所述转基因树的发育中木材中，由所述来自GT43
家族的一种或更多种基因转录的mRNA的水平为相同物种的野生型树中转录的mRNA之相应
水平的25％至85％。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述来自GT43家族的一种或更多种基
因选自：
(a)由以下组成的毛果杨基因的组：
GT43A(SEQIDNO：1)，
GT43B(SEQIDNO：2)，
GT43C(SEQIDNO：3)，
GT43D(SEQIDNO：4)，
GT43E(SEQIDNO：5)，
GT43F(SEQIDNO：6)，
GT43G(SEQIDNO：7)；
(b)与(a)中的所述毛果杨基因直系同源并且与(a)中的基因具有至少80％序列同一性
的基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其中(b)中的所述直系同源基因选自从桉属
(Eucalyptus)、金合欢属(Acacia)或柳属(Salix)中选择的物种。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述来自GT43家族的一种或更多种基
因选自：
GT43B(SEQIDNO：2)，
GT43C(SEQIDNO：3)，和
GT43E(SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃瓦·J·梅莱罗维奇，莱夫·琼森，克里斯蒂娜·拉特克，芭芭拉·捷列比涅茨，尚德拉·维内斯特兰德，
申请(专利权)人：瑞典树木科技公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE