表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法，涉及基因重组人类血清白蛋白在黑麦草基因组中的整合以及转基因植株的筛选。目的是解决目前人血清白蛋白来源有限切价格昂贵的问题。方法：一、以黑麦草成熟胚为外植体诱导愈伤组织；二、菌液的活化与重悬；三、将愈伤组织浸泡于农杆菌重悬液；四、将浸泡后的愈伤组织转入培养基上共培养；五、将愈伤组织转入筛选分化培养基中培养，诱导出抗性再生植物，鉴定为阳性的即为转基因黑麦草。本发明专利技术用于制备表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草。
【技术实现步骤摘要】
技术邻域本专利技术涉及一种转基因黑麦草的制备方法。技术背景人血白蛋白(humanserumalbumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人血液中的主要蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右，每升人血中含有人血白蛋白约40g。除了血浆之外，人血白蛋白还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。HSA前体(preproHSA)在肝脏中合成，并且在高尔基体中被加工剪切，形成成熟的HSA分子，释放到血液中，对保持血液的正常渗透压具有重要作用；它在血液中作为多种疏水性分子的载体，其中包括脂肪酸、胆色素、激素、生物学活性物质及药物等，从而调节人体内的多种生理功能。在体外，它作为多种药物的稳定剂被广泛用于多种疾病的治疗、药物载体、动物细胞培养、血浆替代物等。因此，人血白蛋白是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等。在国际市场上具有巨大的需求，每年的需求量高达500吨以上。目前，临床使用的人血白蛋白主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求。另一方面血液自身也可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的人血白蛋白存在巨大的担忧。随着基因工程和分子生物学的发展，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产重组人血白蛋白，例如利用原核生物如大肠杆菌(MartinLatta,MichaelKnapp,etal.NatureBiotechnology,1309-1314(1987))、枯草芽抱杆菌(CharlesW,SaundersCW,etal.JournalofBacteriology,169:2917-2925(1987))，真核生物如酵母(KaoruKobayashi.Biologicals.34:55-59(2006))、转基因动物培养(ShaniM,BarashI,etal.TransgenicRes,1:195-208(1992))等生产人血白蛋白，但这些方法因表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。此外，已有研究表明在转基因水稻(HeY,NingT,etal.ProcNatlAcadSci.U.S.A.10819078–19083(2011))表达的重组人血白蛋白在理化性质及其功能与人源血清白蛋白相似，但水稻的生长周期相对较长，所以在产业化生产中有一定的局限。
技术实现思路
本专利技术是针对现有原核与真核生物为生物反应器的表达量低、无生物活性和不安全等特点，为解决目前人血白蛋白来源有限及价格昂贵的问题，提供一种表达重组人血白蛋白基因的转基因黑麦草的制备方法。本专利技术表达重组人血白蛋白基因的转基因黑麦草的制备方法，按以下步骤进行：一、将黑麦草种子置于50％H2SO4浸泡处理20-30min去皮，纯水漂洗3-5次，至无多余杂质悬浮，吹干去皮后的种子备用；二、选择饱满的去皮种子进行消毒处理，先将籽粒饱满的种子于75％的乙醇中消毒1min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒5-10min，无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，纵切为两半接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养；三、两周后将愈伤组织分离，转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃、180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50-1:100的接种量接种到100mL含AS100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6-0.8，获得活化菌液；五、取活化后的菌液4000g离心10min，将菌体用愈伤组织诱导培养基中重悬稀释至OD600为0.5-0.6，将步骤二中预培养后的胚性愈伤组织至于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡10-20min，然后取出外愈伤组织吸干表面菌液，转入不定芽诱导分化培养基中，于24-26℃黑暗条件下共培养3d；六、将共培养3d后的愈伤组织用含100mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次，至愈伤组织分化出抗性芽；再将抗性芽转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因黑麦草。人血清白蛋白具有相对稳定的结构特性，相对于原核表达体系和酵母表达体系，采用转基因黑麦草作为生物反应器能更好的进行转录翻译后的修饰，以保证基因重组人血清白蛋白能正确折叠形成具有生物活性的功能蛋白。黑麦草是重要的禾本科牧草，其分蘖多，产量高，质地软，绿期长，是良好的绿色饲料。此外，黑麦草根系发达，适生性强，有耐盐碱潜力等特点，使它成为了外源蛋白物质表达的良好媒介。本专利技术采用农杆菌介导的植物基因转化技术将基因重组人血清白蛋白基因导入黑麦草基因组中，经筛选鉴定后获得含基因重组人血清白蛋白基因的转基因黑麦草植株。目的在于通过以转基因黑麦草为生物反应器规模化生产基因重组人血清白蛋白，从而解决人血白蛋白的来源短缺和价格昂贵的问题。附图说明图1.抗性植株基因组DNAPCR检测结果，+所用PCR模板为含目的基因片段的转基因工程菌株质粒，-所用PCR模板为野生型黑麦草基因组DNA，1-14分别为对卡那霉素具有抗性的再生黑麦草植株基因组DNA的PCR扩增产物。其中编号2、5、10、12及13泳道没有与阳性对照一致的条带，为抗生素假阳性植株，予以剔除；其余泳道均有与阳性对照一致的条带，初步证明其对应植株的基因组中成功转入基因重组人血清白蛋白的基因序列。图2.转基因黑麦草基因组DNAPCR产物第1位至第300位核苷酸测序峰图。图3.转基因黑麦草基因组DNAPCR产物第301位至第600位核苷酸测序峰图。图4.转基因黑麦草基因组DNAPCR产物第601位至第900位核苷酸测序峰图。图5.转基因黑麦草基因组DNAPCR产物第901位至第1200位核苷酸测序峰图。图6.转基因黑麦草基因组DNAPCR产物第1201位至第1500位核苷酸测序峰图。图7.转基因黑麦草基因组DNAPCR产物第1501位至第1761位核苷酸测序峰图。图8.转基因黑麦草蛋白质粗提物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。M为分子标记，+为阳性对照(人血清白蛋白)，-为空白对照，1-7分别是PCR检测呈阳性的黑麦草叶片蛋白粗提物，其中编号4对应的植株没有出现与阳性对照一致的蛋白条带。图9.转基因黑麦草中表达的基因重组人血清白蛋白的WesternBlot结果。M为分子标记，+为阳性对照(人血清白蛋白)，-为空白对照，1-7分别是PCR检测呈阳性的黑麦草叶片蛋白粗提物，其中编号4对应的植株没有出现与阳性对照一致的蛋白质印记条带。具体实施方式一种表达基因重组人血清白蛋白的转基因黑麦草的制备方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
利用转基因黑麦草表达人血清白蛋白的方法，其特征在于植物基因组中整合了人类血清白蛋白基因的转基因黑麦草的制备和筛选方法，按以下步骤进行：（一）将黑麦草种子置于50% H2SO4浸泡处理20‑30分钟去皮，纯水漂洗3‑5次，至无多余杂质悬浮，吹干去皮后的种子备用；（二）选择饱满的去皮种子进行消毒处理，先将籽粒饱满的种子于75%的乙醇中消毒1min，然后用无菌水漂洗一次，再用30%(v/v)次氯酸钠溶液消毒5‑10min，无菌水冲洗5‑6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，纵切为两半接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养；（三）两周后将愈伤组织分离，转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；（四）将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃、180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50‑1:100的接种量接种到100mL含AS 100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6‑0.8，获得活化菌液；（五）取活化后的菌液4000g离心10min，将菌体用愈伤组织诱导培养基中重悬稀释至OD600为0.5‑0.6，将步骤二中预培养后的胚性愈伤组织至于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡10‑20min，然后取出外愈伤组织吸干表面菌液，转入不定芽诱导分化培养基中，于24‑26℃黑暗条件下共培养3d；（六）将共培养3d后的愈伤组织用含100mg/L 羧苄青霉素的无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次，至愈伤组织分化出抗性芽；再将抗性芽转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因黑麦草。...
【技术特征摘要】
1.利用转基因黑麦草表达人血清白蛋白的方法，其特征在于植物基因组中整合了人类血清白蛋白基因的转基因黑麦草的制备和筛选方法，按以下步骤进行：（一）将黑麦草种子置于50%H2SO4浸泡处理20-30分钟去皮，纯水漂洗3-5次，至无多余杂质悬浮，吹干去皮后的种子备用；（二）选择饱满的去皮种子进行消毒处理，先将籽粒饱满的种子于75%的乙醇中消毒1min，然后用无菌水漂洗一次，再用30%(v/v)次氯酸钠溶液消毒5-10min，无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，纵切为两半接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养；（三）两周后将愈伤组织分离，转入继代培养基，每两周继代一次，培养至愈伤组织转变为胚性愈伤组织；（四）将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃、180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50-1:100的接种量接种到100mL含AS100uM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6-0.8，获得活化菌液；（五）取活化后的菌液4000g离心10min，将菌体用愈伤组织诱导培养基中重悬稀释至OD600为0.5-0.6，将步骤二中预培养后的胚性愈伤组织至于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡10-20min，然后取出外愈伤组织吸干表面菌液，转入不定芽诱导分化培养基中，于24-26℃黑暗条件下共培养3d；（六）将共培养3d后的愈伤组织用含100mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，转入不定芽诱导分化培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次，至愈伤组织分...
【专利技术属性】
技术研发人员：王大勇，陈林涛，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南;46
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