克服根癌农杆菌介导小麦幼胚褐化的转化方法及其专用培养基技术

本发明专利技术公开了一种根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法及其专用培养基。本发明专利技术所提供的根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法，包括下述步骤：１）将小麦幼胚接种于预培养的培养基中，２４－２６℃的培养温度下黑暗培养４－７天；２）用目的根癌农杆菌侵染经过步骤１）培养的小麦幼胚、进行共培养，将根癌农杆菌中的目标Ｔ－ＤＮＡ导入小麦幼胚。利用上述根癌农杆菌介导的转化方法将外源基因导入小麦中，经测定，用本发明专利技术的培养基及其转化方法，胚性愈伤组织的诱导率和抗性植株的获得率均得到提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种克服根癌农杆菌介导小麦幼胚褐化的转化方法及其专用其培 养基。技术背景DNA双螺旋结构的发现为分子生物学研究奠定了基础，DNA重组技术的创立使 分子生物学研究由理论进入实践，植物基因工程研究应运而生。在此基础上， Zambryski等利用农杆菌介导法获得了世界上第一株转基因烟草植株，Horch等建立 了农杆菌介导的叶盘转化法，马铃薯、番茄、拟南芥等双子叶模式植物先后转基因 获得成功。此后，植物转基因技术迅速发展，先后建立了除农杆菌介导法以外的PEG 介导法、电激穿孔法、病毒介导法、基因枪法、显微注射法、花粉管通道法和超声 波法等，转基因成功的物种不断扩大，涉及35个科的50多个种，共120多种植物。 经过多年的实践和优胜劣汰，多数转化方法己被逐步放弃，形成了以农杆菌介导法 和基因枪法占主导地位的两大植物转基因体系。迄今为止，媒介农杆菌法获得的转 基因植物占转基因植物总数的85%左右。同时，将一些有利用价值的外源基因导入 植物，并逐步将转基因植物应用到农业生产中。植物基因工程研究已涉及到品种改 良的各个方面，包括抗虫、抗病(病毒、细菌和真菌病害)、抗除草剂、抗逆(寒 冷、盐碱、重金属等)、品质改良(碳水化合物、油脂和蛋白质等)、发育调控和 营养吸收等。在开展主要农作物转基因技术体系和功能基因转化研究的同时，转基 因大豆、玉米、棉花、油菜等作物新品种在生产上的产业化面积逐年增加。在粮食作物中，小麦属于遗传转化最为困难的作物，加上转基因研究起步较晚， 基因工程育种进程明显落后于其它作物。Hessd等(1990) 、 Mooney等(1991)先 后对农杆菌介导法转化小麦的可行性进行了研究，但未能获得转基因植株。随着基 因枪的问世、新的选择标记基因和高效启动子的运用，1991年以后小麦转基因研究 开始增多。1992年Vasil等利用基因枪介导法将ter基因导入了小麦，获得了世界 上第一例转基因小麦植株。1993年Weeks等、Perl等利用基因枪介导法将^/5"基因、 ter基因导入了小麦，建立了基因枪法转化小麦幼胚的技术体系。然而，农杆菌介 导法一直是小麦遗传转化的一道难关。1997年Cheng等首次利用农杆菌介导法将^5"基因和/7;^//基因转入了小麦幼胚愈伤组织，获得了小麦转基因植株，并对转 基因植株T。代-T2代进行了分子检测。夏光敏等(1999)、叶兴国等(2001)利用 农杆菌介导法将"pf//、 ^r等外源基因转入小麦，获得了转基因植株。Zhou等利 用农杆菌介导法将抗除草剂的Roundup基因转入了小麦品种Bobwhite，培育了 Roundup Ready转基因小麦。由于农杆菌介导法的一些独特优点，如转移片段明确、 拷贝数低、容易表达、操作简单和成本低等，人们对此项研究一直坚持不懈。2003 年Khanna等通过构建超级双元表达载体HK21和在培养基中加入多胺类化合物，使 转化效率达到了 1. 2-3. 9%; Hu等以来源于农杆菌的抗除草剂基因EPSPS为选择标 记，以草丁膦为筛选剂，将EPSPS基因导入了小麦品种Bobwhite，转化效率达到了 4. 3%。 Cheng等(2003)认为农杆菌感染后对外植体进行干燥处理可显著提高T-DNA 转运水平和转化效率。小麦转基因研究大多采用授粉后13-14天的幼胚为受体材料，表达载体构建中 普遍采用Ubi、 E35S等启动子和bar、叩tll、 EPSPS、 hpt等筛选标记基因，筛选 剂一般使用Bialaphos、 Glufosinate、 G418和hygromycin等，利用的农杆菌菌系包 括ABI、 Agll、 C58C1、 LBA4404和CP4等。尽管农杆菌介导法取得了一定的进展， 但是目前利用农杆菌转化小麦仍然比较困难，尤其是农杆菌侵染小麦幼胚后愈伤组 织褐化死亡的现象非常严重，不能获得足够数量的抗性愈伤组织和再生植株，是小 麦转基因研究的瓶颈，限制了转基因小麦的规模化生产和小麦功能基因组研究的发 展。因此，解决农杆菌转化小麦幼胚后愈伤组织褐化死亡的问题是小麦转基因研究 的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚用培养基。 本专利技术所提供的根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚用培养基是含有MS基本培养基的大量元素、MS基本培养基的微量元素、MS基本培养基的铁盐、蔗糖、PAA和Dicamba的固体培养基，其中PAA的浓度为0—1.0 mg/L， Dicamba的浓度为2.0—3.0mg/L，蔗糖的浓度为20.0—40.0g/L。上述培养基中PAA的浓度优选为0.5mg/L， Dicamba的浓度优选为2mg/L，蔗糖的浓度优选为30g/L。本专利技术的另一个目的是提供一种根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法。 本专利技术所提供的根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法，包括下述步骤1) 将小麦幼胚接种于上述培养基上，24 — 26。C的培养温度下黑暗培养4-7天；2) 用目的根癌农杆菌侵染经过步骤l)培养的小麦幼胚、进行共培养，将根癌 农杆菌中的目的基因导入小麦幼胚。上述小麦幼胚培养温度优选为25°C，上述根癌农杆菌为含有目标基因的根癌农 杆菌。在进行根癌农杆菌转化之前，可以将用于提供小麦幼胚的小麦植株种植在温度 为15 —25"C的温室中生长发育。上述根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚的方法中还包括将经过共培养的小麦幼 胚转入在每升上述培养基中补充10. Omg G418和250. 0mg羧苄青霉素得到的培养基 中诱导胚性愈伤组织的步骤。上述方法中还包括将得到的胚性愈伤组织进行分化培养并进行生根的步骤。利用本专利技术的培养基及其转化方法，胚性愈伤组织的诱导率和抗性植株的获得 率均得到提高。其中，小麦CB037的胚性愈伤组织的平均诱导率为67. 1%，小麦石 4185的胚性愈伤组织的平均诱导率为56. 4%，小麦Bobwhite的胚性愈伤组织的平 均诱导率为60.9%;小麦CB037抗性植株的平均获得率为24iy。，小麦石4185抗性 植株的平均获得率为204%，小麦Bobwhite抗性植株的平均获得率为283%。 附图说明图1为按照已发文献中的常规根癌农杆菌转化法对小麦CB037的幼胚进行根癌 农杆菌侵染后的培养效果图2为本专利技术培养基和转化方法对小麦CB037的幼胚进行根癌农杆菌侵染后的 培养效果图3为本专利技术培养基和转化方法对小麦石4185的幼胚进行根癌农杆菌侵染后 的培养效果图4为按照已发文献中的常规根癌农杆菌转化法转化小麦CB037后的抗性愈伤 组织的分化情况图5为本专利技术培养基和转化方法转化小麦CB037后的抗性愈伤组织的分化情况 图6为本专利技术培养基和转化方法转化小麦石4185后的抗性愈伤组织的分化情况具体实施方式下述实施例中所涉及的实验方法如无特殊说明均为常规方法。实施例1、根癌农杆菌转化法侵染小麦幼胚一、 培养基的配制和灭菌MSD2P。.5培养基10XMS大量lOOml、 100XMS微量10ml、 200XMS铁盐5ml、 蔗糖30g，定容至1000ml，然后调节pH至6.0，再加入植物凝胶(Phytagel) 2.4g， 以上成分采用12lr高压湿热灭菌20分钟；待灭菌后的培养基温度降至65。本文档来自技高网...

【技术保护点】
根癌农杆菌介导的转化小麦幼胚用培养基，是含有ＭＳ基本培养基的大量元素、ＭＳ基本培养基的微量元素、ＭＳ基本培养基的铁盐、蔗糖、ＰＡＡ和Ｄｉｃａｍｂａ的固体培养基，所述培养基中ＰＡＡ的浓度为０－１．０ｍｇ／Ｌ，所述培养基中Ｄｉｃａｍｂａ的浓度为２．０－３．０ｍｇ／Ｌ，所述培养基中的蔗糖的浓度为２０－４０ｇ／Ｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶兴国，陶丽莉，王艳丽，殷桂香，任贤，魏亦勤，杜丽璞，徐惠君，陈孝，辛志勇，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]