一种植物叶片维管束特异性表达的启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种植物叶片维管束特异性表达的启动子，含有该启动子的植物表达载体和转化子，本发明专利技术还涉及上述启动子在植物转基因工程中的应用。一种植物叶片维管束特异性启动子，其核苷酸序列如ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１所示。发明专利技术人将含有该启动子ＤＮＡ序列和ＧＵＳ基因的植物表达载体经农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因植株，经染色鉴定，ＧＵＳ基因仅仅在水稻叶片微管束中特异表达，因此推测本发明专利技术提供的启动子能够驱动外源抗逆基因在植物叶片微管束中特异表达，可应用于定向培育安全性高的转基因植物新品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种植物维管束特异性表达的启动 子，含有该启动子的植物表达载体，以及该启动子的转化子，本专利技术还涉及上述启 动子在植物转基因工程中的应用。技术背景启动子是位于结构基因5'端上游区域，能被RNA聚合酶识别并与之结合，从 而起始转录基因的一段DNA序列。启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表 达的空间、时间、以及表达量等，是生物转基因工程中至关重要的因素，也是关系 到生物转基因安全的一个重要因素，最早广泛使用的生物转基因启动子是一些组成 型启动子，如来源于CaMV的35S启动子、根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂 碱合成酶基因启动子Nos，章鱼碱合成酶基因启动子Ocs，组成型启动子的特点是在 所有的组织中都启动基因表达，具有持续性，不表现时空特异性，难以达到定向改 造植物性状的目的，往往产生一些不需要的结果，甚至负面的效果，另外组成型启 动子在时空上的持续表达，也造成植物生长资源的浪费。在生物转基因安全方面， 这些组成型启动子的高表达量、强启动效应、对生物种类和组织的不加选择，以及 其来源如病毒的不安全性，使采用该类启动子的转基因生物容易成为基因漂移、外 源基因泛滥表达的源头，使人们非常担心转基因植物的安全性问题，因此，在基因 工程中，定向、安全地改良植物某些形状的先决条件是提供基因时空特异性表达的 启动子，构建高效表达的表达载体，使靶标基因精确地在目的组织内按需表达。维管束是植物重要的功能组织，是输送养分、水分、决定抗逆能力的重要组织， 如果能获得调控基因在维管束中特异表达的启动子，使各种外源抗病基因、抗倒伏 基因都只在维管束中表达，而不在种子中表达，使植株获得抗性的同时，生产出来 的粮食也没有安全隐患，因此分离克隆到这样的启动子，对于植物转基因工程获得 抗性品种具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种驱动外源基因在植物叶片维管束组织特异性表达的启 动子，以及获得含有该启动子序列的转化子。一种植物叶片维管束特异性启动子Op，其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。 一种植物表达载体，其特征是含有上述植物叶片维管束特异性启动子Op。 所述植物表达载体是pCAM-Op。 一种转化子，其特征是含有上述植物叶片维管束启动子0p或植物表达载体 pCAM-0p及宿主。所述转化子为细胞系，愈伤组织或转基因植株。 所述宿主为根癌农杆菌。所述植物叶片维管束特异性启动子Op在培育转基因植物中的应用。 所述转基因植物为水稻。所述应用是将植物叶片维管束特异性启动子0p插入靶标基因前转化植物，使靶 标基因在植物叶片维管束中特异性表达。所述的应用是指抗病育种与抗逆性育种。本专利技术提供的启动子位于表达载体中的靶标基因前，其结构包括翻译起始密码 子在内的bp的DNA序列(SEQIDNOl， +1位置处为转录起始位点；leaderintron序列 以下划线标注)，该DNA片段含有大量的顺式调控元件、并在位于翻译密码子前具有 一段leaderintron序列，将本启动子连接到表达载体中的耙标基因前，可驱动靶标基 因在叶片维管束组织中的特异表达，可以提高外源基因在植物叶片维管束中表达量， 增加转基因的效果，减轻外源基因由于过量表达而对作物农艺性状的影响。在植物双元表达载体pCAMBIA1301中，将GUS报告基因前的启动子缺失，并 将本专利技术的水稻<%S77^基因启动子Op连接到GUS报告基因前，利用农杆菌介导 的遗传转化方法进行水稻的转化。对转基因水稻植株进行组织化学染色后，发现转 基因植株整体上的GUS基因表达水平相对较低，在叶片中仅在叶脉处显蓝色，证明 该启动子具有驱动基因表达的启动活性，且该启动子驱动的GUS基因在水稻叶片维 管束中特异表达。本专利技术启动子在植物基因工程中的应用潜力很大，尤其在开发抗叶片维管束病 害的转基因作物中优势更加明显，可以通过驱动抗病基因在维管束中的特异表达， 而提高植物对叶片维管束病害的抗性；同时维管束是无机盐和有机物质等营养物质 的输导系统，并具有支持植物体的作用，因此，该启动子在转基因作物开发中，可 应用于提高作物抗逆性品种培育研究，由于其微管束组织特异性表达的特性，用其代替35S等组成型启动子，可培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。 附图说明图1A: pCAMBIA1301示意图；图lB:利用启动子Op构建驱动GUS表达的载体pCAM-Op示意图。 图2:利用Op启动子驱动GUS基因表达情况的分析A. 无启动子表达载体转基因水稻植株叶片；B. CaMV35S: :gus转基因水稻植株叶片；c.Op::gus转基因植株叶片；D. 无启动子表达载体转基因水稻植株叶片维管束组织；E. CaMV35S: :gus转基因水稻植株叶片维管束组织f. Op: :gus转基因植株叶片维管束组织具体实施方式现结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例l:含有酶切位点的启动子Op的获得步骤l、引物的设计根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因组序 列，依据水稻O^77^基因的起始密码子上游1380bp序列设计扩增引物，并根据选 用的载体及耙标基因的特点，设计引物的酶切位点，在本实施例中以水稻双元表达 载体pCAMBIA1301 (来自于CAMBIA，公开使用载体，中国农业科学院植物保护 研究所植物病虫害生物学国家重点实验室分子植病组有保存，公众可以从该实验室 得到)为例，靶标基因为GUS基因，具体设计的引物为正向引物Opl 5'端带Bgl II酶切位点，反向引物Op2的5'端带EcoRl酶切位点，引物序列如下正向引物Opl(5'-CAGATCTACCATCTGCATGAAAACATATGGTACTTTGC-3') 柳I反向引物Op2 (5' -CGAATTCGTTGTGATTGGATCTGTGTACCTG-3')由上海生工生物技术公司合成。 步骤2.启动子Op的获得以水稻品种日本晴总DNA为模板，利用Opl、 Op2扩增启动子Op。试剂采用高保真酶，按常规PCR体系，扩增程序采用如下95t预变性15min; 95。C变性40s，57。C退火40s， 72。C延伸lmin30s， 36个循环；最后72t:延伸5min。回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1380bp，连接到pMD18-T (购于 TaKaRa公司，中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室分 子植病组有保存，公众可以从该实验室得到)载体中，按照热激法转化大肠杆菌DH5ci (购于TaKaRa公司)感受态细胞后，经筛选获得转化子pMD18-T-Op，挑取单克隆 用和I进行测序验证。验证正确的克隆即为所要获得的启动子Op(图1)。实验例2:利用Op启动子驱动GUS报告基因在水稻中表达步骤1植物表达载体的构建和农杆菌的转化将实施例1所得pMD18-T-Op用5g/ II和五co及I酶切，回收后与pCAMBIA1301 的￡g/ II和￡coi I酶切载体部分，用T4 ligase(购于Takara生物公司)进行连接，得到 启动子Op与gus基因融合的植物表达载体pCAM-Op (图2)，利用冻融法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物维管束特异性启动子Ｏｐ，其核苷酸序列如ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何晨阳，吴茂森，柏亚男，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]