本发明专利技术公开了一种提高小麦成熟胚再生率的根癌农杆菌介导的转化方法及其专用培养基。本发明专利技术所提供的提高小麦成熟胚再生率的根癌农杆菌介导的转化方法，包括下述步骤：１）将小麦种子灭菌后在无菌水中浸泡１５－１８小时，将浸泡后的小麦种子上的成熟胚刮碎后接种于预培养的培养基中，２３－２５℃的培养温度下黑暗培养７天；２）用目的根癌农杆菌侵染经过步骤１）处理的小麦成熟胚、进行共培养，将目的根癌农杆菌中的目标基因导入小麦成熟胚。利用上述农杆菌介导的转化方法将外源基因导入小麦中，经测定，用本发明专利技术的培养基及其转化方法，小麦成熟胚再生率得到提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。技术背景到目前为止，小麦组织培养成功的外植体包括幼胚、幼穗、花药和成熟胚等， 其中，幼胚再生最为容易，花药培养次之，成熟胚培养最难。所以，幼胚一直被认 为是最理想的组织培养外植体材料，其愈伤组织诱导率和植株再生率都比较高，迄 今获得的转基因小麦基本上都是以幼胚作为外植体。而小麦幼胚的取材受时间、空 间和季节的限制，合适的取材时期难以把握，所取材料的生理状态和发育阶段的一 致性也无法保障，这在一定程度上制约了转基因小麦的应用；而小麦成熟胚取材方 便，不受季节和植株发育阶段等因素的限制，能保证不同个体间生理状态的一致性， 是研究小麦遗传转化最为方便实用的受体材料。在成熟胚处理方面，不同研究者所采取的方式也不尽相同，如完整胚接种、胚 乳支撑接种、成熟胚碎片组织接种和成熟胚切割接种等，其植株再生率最高为10% 左右。在小麦成熟胚培养过程中，培养基和小麦的基因型是关键的影响因素，其中， 激素作为培养基中必不可少的组分，对调节组织和细胞培养中胚状体的发生具有举 足轻重的作用。国内外学者对小麦成熟胚组织培养中诱导培养基和分化培养基中所 添加的激素的种类及其浓度进行了比较研究。其中，2，4-D是小麦成熟胚培养中应 用最广泛的生长调节剂，每升培养基中添加2 8 mg的2，4-D即能够诱导愈伤组织， 但其具体浓度与成熟胚的培养方式密切相关。碎片组织和整粒切胚诱愈法一般用2mg/L的2，4-D，胚乳支撑法则以8 mg/L的2,4-D为宜。高浓度2，4-D能有效抑制 胚发芽，但对愈伤组织的分化不利；细胞分裂素KT在某种程度上能够拮抗高浓度 2,4-D对愈伤组织分化的抑制作用，但对愈伤组织有一定的毒害作用。研究者们还 发现，在成熟胚愈伤组织诱导的起始阶段2，4-D起着非常重要的作用，之后需降低 2,4-D浓度或不添加2,4-D才更有利于胚性愈伤组织的产生。相对于其他单子叶植物，小麦基因工程育种研究远远滞后。限制小麦转基因研 究发展的首要因素是缺乏有效的受体材料及其再生体系。小麦幼胚虽然再生性能比 较强，但在取材的时间和空间上受到很大的限制，适宜转化的生理状态对培养条件的要求比较严格，转化周期比较长。而小麦成熟胚则取材方便，生理状态一致，不 受生长季节限制，是组织培养和遗传转化的理想外植体。另外，以小麦成熟胚作为 遗传转化的受体，不但可以节省时间、空间和能源，提高工作效率，而且更经济、 方便、实用。然而，小麦成熟胚的离体培养比较困难，再生率比较低。如何诱导小 麦成熟胚产生高质量的愈伤组织及提高愈伤组织诱导率是小麦成熟胚转化的关键。 探索小麦成熟胚处理方法，优化小麦成熟胚愈伤组织诱导培养基和农杆菌转化方 法，建立高频率再生体系，对小麦转基因研究将有巨大的推动作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高小麦成熟胚再生率的培养基。本专利技术所提供的提高小麦成熟胚再生率的培养基是含有MS基本培养基的大量 元素、MS基本培养基的微量元素、MS基本培养基的铁盐、B5基本培养基的维生素、 葡萄糖、甘露醇、山梨醇、AgN03、 AS、 MgCl2、半胱氨酸、维生素C、水解酪蛋白、 谷氨酰胺和Dicamba的固体培养基，所述培养基中葡萄糖的浓度为10_15g/L,所 述培养基中甘露醇的浓度为0—15g/L，所述培养基中的山梨醇的浓度为0—15g/L， 所述培养基中AgN03的浓度为0_8mg/L，所述培养基中AS的浓度为0—40mg/L， 所述培养基中MgC^的浓度为0—1.75g/L，所述培养基中半胱氨酸的浓度为0 — 40mg/L，所述培养基中维生素C的浓度为0—100mg/L，所述培养基中水解酪蛋白 的浓度为0—100mg/L，所述培养基中谷氨酰胺的浓度为0 — 500mg/L，所述培养基 中Dicamba的浓度为l一3mg/L。上述培养基中葡萄糖的浓度优选为12g/L、甘露醇的浓度优选为15g/L、山梨醇 的浓度优选为15g/L、 AgN03的浓度优选为4mg/L、 AS的浓度优选为39mg/L、 MgCl2 的浓度优选为0.75g/L、半胱氨酸的浓度优选为40mg/L、维生素C的浓度优选为 100mg/L、水解酪蛋白的浓度优选为100mg/L、谷氨酰胺的浓度优选为5mg/L、 Dicamba的浓度优选为2mg/L。本专利技术的另一个目的是提供一种根癌农杆菌介导的转化小麦成熟胚的方法。本专利技术所提供的根癌农杆菌介导的转化小麦成熟胚的方法，包括下述步骤1) 将小麦种子灭菌后在无菌水中浸泡15-18小时，将浸泡后的小麦种子上的 成熟胚刮碎后接种于上述培养基中，23 — 25。C的培养温度下黑暗培养7天；2) 用目的根癌农杆菌侵染经过步骤1)处理的小麦成熟胚刮碎组织、进行共培 养，将根癌农杆菌中的目的基因导入小麦成熟胚刮碎组织。上述培养温度优选为24°C，上述根癌农杆菌为含有目标基因的根癌农杆菌。 上述根癌农杆菌介导的转化小麦成熟胚的方法中还包括将经过共培养的小麦 成熟胚刮碎组织进行诱导愈伤组织的步骤。上述方法中还包括将得到的愈伤组织进行分化培养并进行生根的步骤。 利用本专利技术的培养基及其转化方法，成熟胚刮碎组织的再生率得到提高。其中，轮选987成熟胚刮碎组织的再生率为84%，邯6172成熟胚刮碎组织的再生率为46%, Bobwhite成熟胚刮碎组织的再生率为42%，郑9023成熟胚刮碎组织的再生率为34%， 石4185成熟胚刮碎组织的再生率为34%，济麦20成熟胚刮碎组织的再生率为32%。 附图说明图1为小麦轮选987成熟胚刮碎组织在Adi预培养培养基上的生长情况图2为小麦轮选987的愈伤组织在XCFH分化培养基上的分化效果图3为小麦邯6172的愈伤组织在XCra分化培养基上的分化效果图4为小麦Bobwhite成熟胚的愈伤组织与农杆菌共培养的情况图5为小麦Bobwhite成熟胚抗性愈伤组织及其在XCra分化培养基上的分化效果图6为小麦Bobwhite T。代转基因植株的PCR检测情况 图7为小麦Bobwhite L代转基因植株的Southern blot检测情况具体实施方式下述实施例中所涉及的实验方法如无特殊说明均为常规方法。 实施例1、农杆菌转化法转化小麦成熟胚 一、培养基的配制和灭菌Adi培养基10XMS大量lOOrnl、 100 XMS微量10ml、 200 X MS铁盐5ml、B5基本培养基的维生素14mg (维生素B1 10rag、维生素B6 lmg、烟酸lmg、甘氨酸 2mg) 、 MgCl20.75g、甘露醇15g、山梨醇15g，定容至950ml，然后调节pH至6.0， 再加入琼脂8g，以上成分采用12rC高压湿热灭菌20分钟；均匀混合下面的几种 成分5mg谷氨酰胺、水解酪蛋白0.5g、葡萄糖12g、乙酰丁香酮(AS) 39mg、 B5 基本培养基的维生素14mg、 3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(Dicamba)2mg、 AgN03 4mg、 半胱氨酸40mg和维生素C 100mg，定容至50ml，过滤灭菌后加入到上述高压灭菌 后的培养基中。Adi培养基的特点是去除了 MS基本培养基中的有机成分，添加了 B5基本培养基的维生素、甘露醇、山梨醇、AgN03、 AS、 MgCl2、半胱氨酸、维生素C、水解酪 本文档来自技高网...
【技术保护点】
根癌农杆菌介导的转化小麦成熟胚用培养基，是含有ＭＳ基本培养基的大量元素、ＭＳ基本培养基的微量元素、ＭＳ基本培养基的铁盐、Ｂ５基本培养基的维生素、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、ＡｇＮＯ↓［３］、ＡＳ、ＭｇＣｌ↓［２］、半胱氨酸、维生素Ｃ、水解酪蛋白、谷氨酰胺和Ｄｉｃａｍｂａ的固体培养基，所述培养基中葡萄糖的浓度为１０－１５ｇ／Ｌ，所述培养基中甘露醇的浓度为０－１５ｇ／Ｌ，所述培养基中的山梨醇的浓度为０－１５ｇ／Ｌ，所述培养基中ＡｇＮＯ↓［３］的浓度为０－８ｍｇ／Ｌ，所述培养基中ＡＳ的浓度为０－４０ｍｇ／Ｌ，所述培养基中ＭｇＣｌ↓［２］的浓度为０－１．７５ｇ／Ｌ，所述培养基中半胱氨酸的浓度为０－４０ｍｇ／Ｌ，所述培养基中维生素Ｃ的浓度为０－１００ｍｇ／Ｌ，所述培养基中水解酪蛋白的浓度为０－１００ｍｇ／Ｌ，所述培养基中谷氨酰胺的浓度为０－５００ｍｇ／Ｌ，所述培养基中Ｄｉｃａｍｂａ的浓度为１－３ｍｇ／Ｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶兴国，殷桂香，王艳丽，陶丽莉，徐明星，徐惠君，杜丽璞，王道文，辛志勇，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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