一种水稻PTC1基因缺失突变体及其分子鉴定方法和应用技术

本发明专利技术提供一种水稻PTC1基因缺失突变体及其应用。本发明专利技术将籼稻品种93‑11经钴60辐射诱变引起水稻基因组第9染色体上，从第15324556位碱基到第15583926位碱基共259370个碱基缺失，该缺失片段包含整个PTC1基因，该缺失基因突变体命名为ptc1‑1664，缺失片段两端核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该缺失位点可以通过核苷酸序列如SEQ ID No.2‑4所示的分子标记来鉴定，该突变体引起水稻隐性雄性核不育，可用于制备隐性雄性核不育的转基因水稻，在水稻种质资源的遗传改良育种中作用重大。本发明专利技术还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种制种中的应用。

A rice PTC1 gene deletion mutant and its molecular identification method and Application

The invention provides a rice PTC1 gene deletion mutant and its application. This invention has induced the rice genome ninth chromosomes by cobalt 60 radiation induced by 93 indica rice variety 11. The deletion of 259370 base bases from 15324556th base to 15583926th base, the missing fragment contains the whole PTC1 gene, the deletion gene is named Ptc1 1664, and the nucleotide sequence at both ends of the missing fragment, such as SEQ ID No. 1, the deletion site can be identified by molecular markers shown by nucleotide sequences, such as SEQ ID No.2 4, which can cause Recessive Male Sterility in rice, and can be used in the preparation of transgenic rice with recessive male sterility, which plays an important role in genetic improvement breeding of rice germplasm resources. The invention also provides a molecular marker identification method for the mutant and its application in breeding seed production.

【技术实现步骤摘要】
一种水稻PTC1基因缺失突变体及其分子鉴定方法和应用
本专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及一种水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664及其分子鉴定方法和应用。
技术介绍
植物雄性不育突变是自然界中十分普遍的现象，至少己在43个科、162个属的617个物种中发现了雄性不育突变体。在遗传上植物雄性不育分为细胞核雄性不育，细胞质雄性不育和细胞核细胞质互作雄性不育三大类：1)细胞核雄性不育由细胞核基因突变产生，有显性突变和隐性突变，有孢子体基因突变和配子体基因突变。显性突变和配子体基因突变只能通过雌配子遗传，隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传，而且遵循孟德尔定律。目前已克隆了一些孢子体隐性核不育基因，如拟南芥的ms2，玉米的ms45和水稻的mil1等；一些配子体隐性核不育基因也被克隆，如拟南芥的两个小孢子有丝分裂异常的突变体sidecarpollen和geminipollen；玉米上还克隆了一个孢子体显性核不育基因MS44；2)细胞质雄性不育则是由细胞质基因控制，并没有相对应的核恢复基因，属母性遗传；3)细胞核细胞质互作雄性不育由细胞质基因和细胞核基因共同控制，其实质是细胞质与细胞核遗传物质不和的结果。不育细胞质是一些由突变线粒体基因引起，但有相对应的核恢复基因，能抑制不育细胞质基因。不育细胞质基因可产生一种新的蛋白质，够影响线粒体正常功能。在育恢复基因方面，目前水稻中已经克隆了Rf-1，Rf-2，Rf-4，Rf-5等基因。水稻是我国的民族产业，杂交水稻对提高我国粮食产量发挥了重要作用。目前，我国杂交水稻累计种植面积超过45亿亩，杂交水稻种植面积已经占到全国水稻种植面积的55％左右。杂种水稻是选用两个遗传背景不同，同时性状又能互补的水稻品种，通过杂交产生具有杂种优势的第一代杂交种用于生产。杂交水稻具有明显的杂种优势现象，主要表现在生长旺盛，根系发达，穗大粒多，抗逆性强等方面。杂交水稻比常规稻增产达30％。目前我国种植的杂交水稻可分为三系法杂交稻和两系法杂交稻。三系法杂交稻(三系杂交稻)就是生产这种杂交稻需要三个水稻品系来完成：水稻质核互作雄性不育系、水稻细胞质雄性不育保持系和水稻细胞质雄性不育恢复系。水稻质核互作雄性不育系(简称不育系，代号A)有野败型，红莲型等多种细胞质类型。水稻细胞质雄性不育保持系(简称保持系，代号B)是用来繁殖不育系一种水稻。其细胞核基因型与不育系相同，但含有可育细胞质基因，可产生可育花粉，能够自交结实。由于保持系的核基因不含恢复基因，因此它给不育系授粉产生的后代也是不育的。水稻细胞质雄性不育恢复系(简称恢复系，代号R)携带恢复基因，能够修复细胞质雄性不育性，与不育系杂交产生的杂种(即杂交稻)正常可育。三系育种法存在感病、品质差、育种效率低等问题。因受恢保关系的制约，95％的水稻资源不能用于杂交育种。两系法杂交稻利用光温敏核不育突变体，其在长日高温条件下表现雄性不育，可进行杂交制种，短日低温条件下表现雄性可育，可以自交繁殖。与三系法相比，两系法具有显著的优越性：不育系与恢复系配组自由，选配优良组合几率大；不育系可一系两用。但是两系法不育系易受光温环境影响，育种风险巨大。比如在制种期间遇上低温，不育系将转为可育，产生自交种子，影响杂交种子的纯度；有的两系杂交种遇上高温则不育，影响结实率，导致减产。因此，寻找新的雄性不育制种方法依然是作物育种上的重要研究课题。通过自然突变体鉴定和人工诱变比如物理辐射，化学处理，组织培养等方法，人们在水稻上获得了多种新的不育突变体。ptc1突变体就是其中之一。其突变体的花药明显变小、变白，不产生成熟花粉粒。该突变体由PTC1基因第二外显子上一个T碱基插入引起。PTC1基因有3个外显子和两个内含子，编码一个680个氨基酸的PHD锌指蛋白，是水稻绒毡层细胞程序性死亡的重要调控因子。PTC1在水稻花药发育第8、9阶段的绒毡层细胞和小孢子中特异表达，调控着绒毡层细胞的发育及降解。在PTC1的缺失突变体植株中，绒毡层细胞无限制扩增及增大，导致绒毡层细胞降解延迟；小孢子从四分体脱落后，乌氏体形成异常，导致花粉壁发育缺陷，引起完全雄性不育。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664及其分子鉴定方法和应用。本专利技术首先对籼稻品种93-11种子(M0代)进行钴60辐射诱变处理，种植处理的种子获M1代植株；M1代植株自交产生种子(为M2代)，种植M2代植株，对M2代植株进行形态学，组织学和遗传学鉴定，筛选不育植株；然后对不育植株进行基因测序和DNA序列分析，在分子水平上进行验证。最后获得纯合不育单株，并用于杂交育种和生物技术研究。本专利技术提供的水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664，其为水稻基因组(基因组版本ASM465v1)第九染色体上，从第15324556位碱基开始到第15583926位碱基共259370个碱基缺失，该缺失片段包含整个PTC1基因。进一步地，水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664，其相对于野生型缺失片段两端核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术提供了水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664在制备转基因植物中的应用。本专利技术提供了水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。本专利技术提供了水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664在水稻改良育种、制种中的应用。本专利技术还提供了检测水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664的分子标记，该分子标记是由以下引物组合的引物扩增获到，所述引物组合含有3条引物，其核苷酸序列分别为：上游引物1664_F1：CATCTCGCAGTTTACATGCAG(如SEQIDNO.2所示)下游引物1664_R1：AGTCTACTCGAGCTACTACCG(如SEQIDNO.3所示)。下游引物1664_R2：CCATCTGAAACTAGTACTCCCA(如SEQIDNO.4所示)。本专利技术提供了上述分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。本专利技术提供了上述分子标记在水稻种质资源改良中的应用。一种检测水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664的方法，通过下述引物组合扩增待检植物基因组DNA，并用琼脂糖电泳检测：所述引物对的核苷酸序列为：上游引物1664_F1：CATCTCGCAGTTTACATGCAG(如SEQIDNO.2所示)下游引物1664_R1：AGTCTACTCGAGCTACTACCG(如SEQIDNO.3所示)。下游引物1664_R2：CCATCTGAAACTAGTACTCCCA(如SEQIDNO.4所示)。如果用上述引物组合扩增出的产物为811bp，则标志着该待检植物PTC1基因型为野生型；如果扩增产物为546bp，则标志着该待检植物PTC1基因型为ptc1-1664突变体；如果扩增产物为546bp、811bp两条带型，则标志着该待检植物PTC1基因型为野生型和ptc1-1664突变体的杂合基因型。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术提供了一种新的水稻隐性核雄性不育突变体，为发展新的雄性不育制种方法奠定了材料基础。(2)本专利技术的水稻ptc1-1664突变体只影响雄性育性，造成雄性完全不育，但对雌性育性和其它农本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻PTC1基因缺失突变体ptc1‑1664，其为水稻基因组版本ASM465v1第9染色体上，从第15324556位碱基开始到第15583926位碱基共259370个碱基缺失，该缺失片段包含整个PTC1基因。

【技术特征摘要】
1.一种水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664，其为水稻基因组版本ASM465v1第9染色体上，从第15324556位碱基开始到第15583926位碱基共259370个碱基缺失，该缺失片段包含整个PTC1基因。2.如权利要求1所述水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664，其缺失片段两端侧翼核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.权利要求1或2所述的水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664在制备转基因植物中的应用。4.权利要求1或2所述的水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。5.权利要求1或2所述的水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664在水稻改良育种、制种中的应用。6.检测权利要求1或2所述的水稻PTC1基因缺失突变体ptc1-1664的分子标记，其特征在于，该分子标记是由以下引物组合扩增得到，所述引物组合含有3条引物，其核苷酸序列分别为：上游引物1664_F1：CATCTCGCAGTTTACATGCAG，下...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄培劲，龙湍，李京琳，李新鹏，曾翔，吴永忠，
申请(专利权)人：海南波莲水稻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：海南,46