一种抵御冷冻胁迫乳杆菌基因工程菌的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术为一种选育抵御冷冻胁迫乳杆菌的系统方法，主要包括高效率乳杆菌电转化感受态的制备，导入谷胱甘肽基因的质粒ｐＮＺ３２０３的提取，ＮＩＣＥ表达系统构建的质粒ｐＮＺ９５３０的提取，质粒ｐＮＺ３２０３和ｐＮＺ９５３０的导入，以及谷胱甘肽基因的诱导表达。通过一整套系统方法，可以在３－５天内快速的得到有效表达谷胱甘肽的目的菌。谷胱甘肽基因的表达，有效提高了乳杆菌在冷冻胁迫条件下的存活率，降低了乳杆菌在传统保藏条件下的死亡率。此外，由于ＮＩＣＥ表达系统的诱导物ｎｉｓｉｎ对人体安全无害，这一构建思路能够用于后续食品级乳杆菌的研究使用。
【技术实现步骤摘要】
，本专利技术利用高效率乳杆菌电转化感受态的制备，大肠杆菌谷胱甘肽基因的导入，NICE表达系统的构建， 以及谷胱甘肽基因的诱导表达，进行该基因工程菌的构建。属于生物工程技术 领域。
技术介绍
乳杆菌是一类使用广泛的益生菌，在食品发酵行业被广泛应用。由于乳杆 菌的最适生长温度一般在30。C-37。C，而在实际生产中，起酵物的冷冻保藏、低 温培育和发酵产品的冷藏过程都将使乳杆菌要经历远低于最适生长温度的冷冻 条件，从而影响其生命力。研究发现，乳杆菌胞内谷胱甘肽含量的增加能显著提高其对于冷冻胁迫的 耐受能力，但部分乳杆菌本身不具备合成谷胱甘肽的能力，或合成谷胱甘肽的 能力较弱。将谷胱甘肽合成基因导入乳杆菌，使其在少量食品级诱导物nisin的 诱导下，自身合成谷胱甘肽，提高乳杆菌对于冷冻条件的适应能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，提 高乳杆菌对于冷冻条件的适应能力。本专利技术的技术方案的详细描述 一种抵御冷冻胁迫乳杆菌基因工程菌的构 建方法，通过高效率乳杆菌电转化感受态的制备，导入谷胱甘肽基因的质粒pNZ3203的提取，NICE表达系统构建的质粒pNZ9530的提取，质粒pNZ3203 和pNZ9530的导入，以及谷胱甘肽基因的诱导表达；步骤为(1)高效率乳杆菌电转化感受态的制备a) 挑旧金山乳杆菌DSM2045lT单菌落接种到MMRS培养液中，30°C静置 培养过夜；b) 2% v/v接种至20 mL MMRS培养液中，30°C静置培养细胞006()0至 0.5-0.8;c) 培养物装至50mL预冷的无菌离心管中，5000 rpm、 5min离心去上清， 收集菌体；e)用与菌体等体积预冷的PEB-1洗涤菌体两次；e)用200 pL预冷的PEB-1重悬菌体，按每份40 pL分装于5份1.5 mL离心管中，保存于-80。C或直接转化；(2) 质粒pNZ3203的提取f) 乳酸乳球菌NZ9000的培养挑选含有插入了谷胱甘肽合成关键酶的基 因gshA和gshB的质粒pNZ3203的乳酸乳球菌NZ9000单菌落接种到含有25 pg/mL氯霉素的15mLGM17培养液中，30°C、 200rpm培养过夜；g) 质粒pNZ3203的提取合并步骤f)菌悬液100 mL，用博大泰克公司生 产的革兰氏阳性菌大量质粒提取试剂盒按使用说明提取质粒pNZ3203，并用200 pL无菌水溶解质粒pNZ3203;(3) 质粒pNZ9530的提取h) 乳酸乳球菌MG1363的培养挑选含有插入了协助pNZ3203构成NICE 表达系统的质粒pNZ9530的乳酸乳球菌MG1363单菌落接种到含有红霉素50 pg/mL的15mLGM17培养液中，30°C、 200rpm培养过夜；i) 质粒pNZ9530的提取合并步骤h)菌悬液100 mL，用博大泰克公司生产 的革兰氏阳性菌大量质粒提取试剂盒按使用说明提取质粒pNZ9530，并用200无菌水溶解质粒pNZ9530;(4) 质粒pNZ3203和pNZ9530的导入j)取1 pL质粒pNZ3203和1 fiL质粒pNZ9530与40 的上述步骤e)所得 的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，冰浴10min;1)采用电穿孔仪进行电转化电压1.75kV;电容25^lF;电阻100 Q;1)电击完毕向电转化杯中加入400 添加了质量体积分数15%蔗糖的 MRS培养液，转移至1.5mL的离心管中，30°C静置活化2-3 h;m)取步骤l)所得的培养液100 pL涂布在含有25 pg/mL氯霉素和50 pg/mL 红霉素的MMRS琼脂平板，30。C静置培养至菌落出现；(5) 谷胱甘肽基因的诱导表达n)将步骤m)所得单菌落接种到含有25 pg/mL氯霉素和50 pg/mL红霉素的 MMRS培养液中，30°C静置活化2-3 h;o)在步骤n)所得培养液中添加终浓度为2 ng/mL的nisin和5 mmol/L的 L-半胱氨酸，30。C培养36-48h，得到能在nisin诱导下自身产生谷胱甘肽的旧金 山乳杆菌DSM2045r基因工程菌菌悬液。所述的抵御冷冻胁迫乳杆菌基因工程菌的构建方法，构建了能在乳链菌肽 (nisin)诱导作用下自身产生谷胱甘肽的旧金山乳杆菌DSM2045r基因工程菌, 从而显著提高菌体在冷冻保藏条件下的存活率。相关培养基GM17培养基5g/L胰蛋白胨，5g/L大豆胨，5g/L牛肉膏，2.5 g/L酵母 膏，0.5g/L抗坏血酸，0.25g/LMgSO4'7H2O， 1 g/L蔗糖，15g/L葡萄糖，19 g/L5磷酸甘油二钠，pH调节至6.9;PEB-1缓冲液272 mmol/L蔗糖，0.5 mmol/L MgCl2 ， 0.5 mmol/L KH2P04/K2HP04 (pH7.4);MMRS培养基10g/L蛋白胨，8g/L牛肉膏，4g/L酵母膏，20 g/L葡萄糖， 5g/L麦芽糖，5g/L醋酸钠，2g/L柠檬酸铵，lg/L吐温80， 2g/L磷酸氢二钾， 0.2 g/L七水硫酸镁，0.05 g/L四水硫酸锰，pH调节至6.2。本专利技术的有益效果本专利技术为一种抵御冷冻胁迫乳杆菌基因工程菌的构建 方法，主要包括高效率乳杆菌电转化感受态的制备及转化；大肠杆菌谷胱甘肽 基因的导入；NICE表达系统的构建以及谷胱甘肽基因的诱导表达。通过一整套 系统方法，可以在3-5天内快速的得到有效表达谷胱甘肽的目的菌。谷胱甘肽基 因的表达，有效提高了乳杆菌在冷冻胁迫条件下的生存力，降低了乳杆菌在传 统保藏条件下的死亡率。此外，由于NICE表达系统的诱导物nisin对人体安全 无害，这一构建思路能够用于后续食品级乳杆菌的研究使用。 具体实施例方式实施例1按照上文所述方法，将活化后的旧金山乳杆菌DSM2045r于30。C静置培 养细胞OD6oo至0.5-0.8。菌悬液装至50 mL预冷的无菌离心管中，5000 rpm、5 min 离心去上清，收集菌体，并用等体积预冷的PEB-1洗涤菌体两次。用200pL预 冷的PEB-1重悬菌体，按每份40pL分装于5份1.5mL离心管中，从而得到旧 金山乳杆菌DSM20451T电转化感受态。实施例2按照上文所述方法，在添加终浓度25pg/mL氯霉素的培养条件下，从之前 构建的乳酸乳球菌NZ9000(pNZ3203)中大量提取出含有谷胱甘肽合成关键酶基 因gshA和gshB的质粒pNZ3203;并在添加终浓度50 pg/mL红霉素的培养条件 下，从之前构建的乳酸乳球菌MG1363(pNZ9530)中大量提取出含有在nisin诱导 下启动pNZ3203表达的质粒pNZ9530。然后利用电转化方法将质粒pNZ3203与 质粒pNZ9530共同转入旧金山乳杆菌DSM204511电转化感受态，从氯霉素+红 霉素抗性平板上得到目的菌能在nisin诱导下自身产生谷胱甘肽的旧金山乳杆 菌DSM2045r基因工程菌菌悬液。实施例3将实施例1中所得旧金山乳杆菌DSM2045r基因工程菌在4。C冷冻胁迫30 d后，存活率由原始菌的0.09%提高到0.76%;在-20。C冷冻胁迫30 d后，存活 率由原始菌的0.60%提高到3.84%。权利要求1、，其特征是通过高效率乳杆菌电转化感受态的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抵御冷冻胁迫乳杆菌基因工程菌的构建方法，其特征是：通过高效率乳杆菌电转化感受态的制备，导入谷胱甘肽基因的质粒ｐＮＺ３２０３的提取，ＮＩＣＥ表达系统构建的质粒ｐＮＺ９５３０的提取，质粒ｐＮＺ３２０３和ｐＮＺ９５３０的导入，以及谷胱甘肽基因的诱导表达；步骤为： （１）高效率乳杆菌电转化感受态的制备： ａ）挑旧金山乳杆菌ＤＳＭ２０４５１↑［Ｔ］单菌落接种到ＭＭＲＳ培养液中，３０℃静置培养过夜； ｂ）２％ ｖ／ｖ接种至２０ｍＬ ＭＭＲＳ培养液中，３０℃静置培 养细胞ＯＤ↓［６００］至０．５－０．８； ｃ）培养物装至５０ｍＬ预冷的无菌离心管中，５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ离心去上清，收集菌体； ｄ）用与菌体等体积预冷的ＰＥＢ－１洗涤菌体两次； ｅ）用２００μＬ预冷的ＰＥＢ－１重悬菌体 ，按每份４０μＬ分装于５份１．５ｍＬ离心管中，保存于－８０℃或直接转化； （２）质粒ｐＮＺ３２０３的提取： ｆ）乳酸乳球菌ＮＺ９０００的培养：挑选含有插入了谷胱甘肽合成关键酶的基因ｇｓｈＡ和ｇｓｈＢ的质粒ｐＮＺ３２０３的乳酸乳球 菌ＮＺ９０００单菌落接种到含有２５μｇ／ｍＬ氯霉素的１５ｍＬ ＧＭ１７培养液中，３０℃、２００ｒｐｍ培养过夜； ｇ）质粒ｐＮＺ３２０３的提取：合并步骤ｆ）菌悬液１００ｍＬ，用博大泰克公司生产的革兰氏阳性菌大量质粒提取试剂盒按使用说明 提取质粒ｐＮＺ３２０３，并用２００μＬ无菌水溶解质粒ｐＮＺ３２０３； （３）质粒ｐＮＺ９５３０的提取： ｈ）乳酸乳球菌ＭＧ１３６３的培养：挑选含有插入了协助ｐＮＺ３２０３构成ＮＩＣＥ表达系统的质粒ｐＮＺ９５３０的乳酸乳球菌ＭＧ１ ３６３单菌落接种到含有红霉素５０μｇ／ｍＬ的１５ｍＬ ＧＭ１７培养液中，３０℃、２００ｒｐｍ培养过夜； ｉ）质粒ｐＮＺ９５３０的提取：合并步骤ｈ）菌悬液１００ｍＬ，用博大泰克公司生产的革兰氏阳性菌大量质粒提取试剂盒按使用说明提取质粒 ｐＮＺ９５３０，并用２００μＬ无菌水溶解质粒ｐＮＺ９５３０； （４）质粒ｐＮＺ３２０３和ｐＮＺ９５３０的导入： ｊ）取１μＬ质粒ｐＮＺ３２０３和１μＬ质粒ｐＮＺ９５３０与４０μＬ的上述步骤ｅ）所得的菌体混匀，转至０．２ｃｍ冰预冷 的电转化杯中，冰浴１０ｍｉｎ； ｋ）采用电穿孔仪进行电转化：电压１．７５ｋＶ；电容２５μＦ；电阻１００Ω； １）电击完毕向电转...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，薛峰，张娟，堵国成，廖鲜艳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。