本发明专利技术公开了一株大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）LL016，其保藏号为CCTCC?NO：M?2012429。本发明专利技术还公开了上述大肠埃希氏菌LL016在利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸中的应用以及方法。该菌株可以在厌氧条件下，利用无机氮源和葡萄糖生长，并大量积累丁二酸，菌株LL016生长速率较快，且产酸量较高，具有重大的社会意义和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株大肠埃希氏菌LL016及其应用，特别涉及一株能够利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸的大肠埃希氏菌LL016及其应用，属于工业微生物育种及其发酵
技术介绍
丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸作为TCA循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物之一，在生物代谢过程中占有非常重要的地位。近年来的研究结果表明丁二酸还可以作为C4平台化合物合成1，4-丁二醇、四氢呋喃、Y-丁内酯等大宗化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解聚酯。近年来，随着化石资源的日益枯竭和环境问题的日益严重，采用生物法制备丁二酸备受瞩目，美国能源部将丁二酸列为未来12种最有价值的生物炼制产品之一。相对于化学合成法，生物合成制备丁二酸的方法受到越来越多的关注。生物合成丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发酵生产丁二酸，相对于化学合成的方法，其一大优势是原材料为廉价的生物质资源，利用生物法合成丁二酸成为近年来研究的热点。发酵菌株是丁二酸生物合成的关键点之一，多数细菌和真菌都能产生丁二酸，但是只有部分菌株可产生高浓度的丁二酸，丁二酸工业生产菌包括一些丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌。目前，丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺菌(,AnaerobiospiriIlum succiniciproducens),产丁二酸放线杆菌(Actinobacillus ■swcciflogefles),谷氛酸棒杆菌(Corynebacterium glutam ica )和大肠杆菌{Escherichia col )等。哀中Escherichia coli由于遗传背景清楚,基因操作简单,生长速度快,易调控以及所用培养基较为廉价，近年来成为生物法制备丁二酸的研究热点。提高丁二酸的发酵产酸能力有很多的方法，尤其在发酵调控的手段上，很多的科研工作者都进行了深入的研究。G. N. Vemuri等人报道利用大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的方法，原理是有氧阶段使菌体得到快速积累，然后转为厌氧使菌体产生大量的丁二酸。由于两阶段发酵的局限性以及复杂性，最近一步厌氧发酵产丁二酸受到越来越多的关注。然而纯厌氧条件下，大肠杆菌利用合成培养基生长并积累丁二酸的研究却鲜有报道。可见，通过改良菌株，使其可以在纯厌氧条件下利用合成培养基快速生长并大量积累产酸，在今后的丁二酸生长工业中具有举足轻重的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株大肠埃希氏菌，能够在厌氧条件下利用合成培养基生长，并且可以积累丁二酸。本专利技术的另一目的是提供上述大肠埃希氏菌在利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸中的应用。本专利技术的第三个目的是提供上述大肠埃希氏菌利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下一、一株大肠埃希氏菌co7i ) LL016，其保藏号为 CCTCC NO M 2012429。本专利技术的大肠埃希氏菌co7i)LL016是将大肠杆菌的出发菌株大肠埃希氏菌coli) BAO16 (CCTCC NO M 2012350)经等离子体诱变后，利用合成培养基平板筛选得到能够在厌氧条件下生长的菌株，在经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高产丁二酸的菌株为目标菌株。其具体步骤如下(1)等离子诱变将大肠杆菌原始菌株在试管中活化，37°c，200r/min，过夜培养。得到的菌液用无菌生理盐水稀释至OD6tltl=L 0，滴加在无菌载片上，用无菌风吹干；以氦气为放电气体，以80 120 W为射频功率，以10 30 SLM作为气体流量，以10 30 s为辐照时间， 对菌株进行等尚子体诱变；(2)合成培养基平板初筛将诱变后的载片置于装有ImL的生理盐水的具塞试管中， 剧烈震荡，将载片上的菌液洗脱，稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上，37°C厌氧培养24 h。挑选生长较大，较为饱满的菌落；(3)合成培养基平板复筛将步骤(2)中筛选到的菌株在合成培养基上反复转点培养， 37°C厌氧培养24 h，挑选生长较大，较为饱满的菌落；(4)厌氧摇瓶发酵筛选将步骤(3)中筛选出的菌株接种到种子培养基中扩大培养， 37°C, 200 r/min，培养48 h，然后在发酵培养基中发酵，接种量为2% (v/v)，30°C，170 r/ min，培养72 h ;考察步骤3)中筛选出的菌落中筛选出生长速度快，产酸量高的菌株。在上述筛选方法中，步骤(I)中所述的等离子体诱变方法中，选择100 W为射频功率，20 SLM为气体流量，15 s为辐照时间。在上述筛选方法中，种子培养基为蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L, NaCl 5 g/L。发酵培养基为柠檬酸3 g · L—1，Na2HPO4 · 12H20 4 g · L—1，KH2PO4 8 g · L (NH4)2HPO4 8 g·!/1，NH4Cl O. 2 g · Γ1，(NH4)2SO4 O. 75 g · Γ1，MgSO4 · 7Η20 I g.L CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · Γ1，CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Γ1，H3BO3 O. 12 mg · Γ1，Al2(SO4)3 I. 77 mg ·] Na2MoO4 ·2Η20 0.5 mg.L—1，柠檬酸铁 16. I mg.L—1，维生素 B1 20 mg .L—1，生物素 2 mg *L_ 碱式碳酸镁16 g/L，葡萄糖20 g/L。固体平板培养基为:柠檬酸3 g · ΙΛ Na2HPO4 · 12Η20 4 g · Λ KH2PO4 8 g · Γ (NH4)2HPO4 8 g.L-1，NH4Cl O. 2 g · Γ1，(NH4)2SO4 O. 75 g · Γ1，MgSO4 · 7Η20 I g.L CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · Γ1，CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Γ1，H3BO3 O. 12 mg · Γ1，Al2(SO4)3 I. 77 mg ·] Na2MoO4 ·2Η20 0.5 mg.L—1，柠檬酸铁 16. I mg.L—1，维生素 B1 20 mg .L—1，生物素 2 mg·] 琼脂20 g/L，葡萄糖10 g/L。二、上述的大肠埃希氏菌{Escherichia coli) LLO16在利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸中的应用。三、上述的大肠埃希氏菌{Escherichia coli) LLO16利用合成培养基纯厌氧发酵生产丁二酸的方法，包含如下步骤(O平板培养将大肠埃希氏菌LL016接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为 37 °C，培养时间为24 h ；(2)种子培养将平板培养的大肠埃希氏菌LL016接种到种子培养基中，充二氧化碳2 m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株大肠埃希氏菌（Escherichia？coli）LL016，其保藏号为CCTCC？NO：M？2012429。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜岷，梁丽亚，刘嵘明，万青，陈旭，任心怡，马江锋，陈可泉，韦萍，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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