本发明专利技术公开了一种食源性致病微生物检测的扩增引物和液相芯片试剂盒，所述试剂盒包括针对待检测微生物基因设计的扩增引物对，所述待检测微生物的正向引物和反向引物包括有以下至少一对：针对阪崎肠杆菌的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、针对单核细胞增生性李斯特氏菌的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、针对大肠埃希氏菌O157的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、针对金黄色葡萄球菌的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、针对志贺氏菌的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、针对沙门氏菌SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、针对副溶血性弧菌的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；和包被有Anti-tag序列的磁珠。本发明专利技术设计的扩增引物具有非常好的特异性，能准确区分和特异性扩增各种目标检测致病微生物相应的基因片段。而且，本发明专利技术设计的检测试剂盒，其灵敏度得到极大提高，从实验结果可知，七种食源性致病微生物的检测灵敏度可达10CFU/mL。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体的是涉及食源性致病微生物检测的扩增引物和 液相芯片试剂盒。
技术介绍
致病微生物污染是餐饮服务环节加工制作过程中产生食品安全风险的主要来源 之一，从食品原料、加工过程、餐饮具各环节均有可能带入致病微生物污染餐饮食品，增加 食品安全风险。常见的致病菌有：阪崎肠杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、大肠埃希氏菌 0157、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌等。 食源性致病微生物的检测技术是食源性疾病的预防与控制的关键技术环节。目 前，检测食品中食源性致病微生物的方法有传统方法（国家标准GT4789)、基于核酸为基础 的方法（实时荧光PCR、普通PCR方法和环介导恒温扩增法）和免疫学方法（如酶联免疫 吸附法（ELISA)、免疫胶体金法）。传统的细菌鉴定主要依靠细菌培养、血清学、生物化学及 细菌形态学等方法进行分类鉴定，传统方法虽然准确、全面，但检测周期长、程序复杂、所需 试剂繁多，实际检测工作量巨大；免疫胶体金是应用较为普遍的方法之一，但其特异性及灵 敏度较低；酶联免疫吸附法（ELISA)技术要求低，携带方便，常以试剂盒的形式出现且易商 品化，是目前应用最为广泛和成熟的技术，但该方法需要高质量抗体，检测成本大且操作过 程繁琐；普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性，一次反应只可以检测一个指 标，不能满足实际需求。 此外，也有现有技术公开用剿式PCR结合荧光微球信号进行检测，该方法很大程 度上提高了检测的准确性和灵敏度。但该方法依然比较复杂，且因食源性致病微生物检测 的复杂性，检测方法的灵敏度还需要提高。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的之一是提供一种特异性强、灵敏度高和检测方法简单的食 源性致病微生物检测液相芯片试剂盒，用于单独或者任意组合检测阪崎肠杆菌、单核细胞 增生性李斯特氏菌，大肠埃希氏菌0157,金黄色葡萄球菌，志贺氏菌，沙门氏菌、副溶血性弧 菌。 实现上述目的的技术方案如下。 -种食源性致病微生物检测液相芯片试剂盒，包括有： (A)针对待检测微生物基因设计的扩增引物对，每对扩增引物包括有扩增引物F1 和扩增引物R1，所述扩增引物F1从5'端至3'端依次由tag序列，间隔臂，每种相应待检 测微生物的正向引物组成，所述扩增引物R1为5'端带有生物素标记的、对应待检测微生物 的反向引物；所述tag序列选自SEQ ID NO. 17-SEQ ID N0. 28 ;所述间隔臂选自C3Spacer、 Spacer9、dSpacer、3，C6Spacer、Spacerl2、Spacerl8 或 PC Spacer 中的任一种；所述待检 测微生物的正向引物和反向引物包括有以下至少一对：针对阪崎肠杆菌的SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2、针对单核细胞增生性李斯特氏菌的SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4、针对大肠埃 希氏菌0157的SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6、针对金黄色葡萄球菌的SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8、针对志贺氏菌的SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10、针对沙门氏菌SEQ ID NO. 11和 SEQ ID NO. 12、针对副溶血性弧菌的 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 ; (B)包被有Anti-tag序列的磁珠，所述Anti-tag序列与相应的待检测微生物的 tag序列互补配对，所述Anti-tag序列选自SEQ ID NO. 29-SEQ ID NO. 40;针对不同待检测 微生物的磁珠具有不同的荧光编码。 在其中一个实施例中，所述待检测微生物的正向引物和反向引物还包括有针对内 控细菌的 SEQ ID Να 15 和 SEQ ID Να 16。 在其中一个实施例中，所述间隔臂为C3SpaCer。 在其中一个实施例中，所述tag序列为：针对阪崎肠杆菌的SEQ ID NO. 17、针对单 核细胞增生性李斯特氏菌的SEQ ID NO. 18、针对大肠埃希氏菌0157的SEQ ID NO. 19、针 对金黄色葡萄球菌的SEQ ID NO. 20、针对志贺氏菌的SEQ ID NO. 21、针对沙门氏菌SEQ ID NO. 22、针对副溶血性弧菌的SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 23。 在其中一个实施例中，针对内控细菌的tag序列为SEQ ID NO. 24。 在其中一个实施例中，所述磁珠和Anti-tag序列之间还设有间隔臂序列；进一步 地，所述间隔臂序列优选为5 - 10个T。 本专利技术的另一目的是提供一种食源性致病微生物检测的扩增引物。 实现上述目的的技术方案如下。 食源性致病微生物检测的扩增引物，包括有以下至少一对：针对阪崎肠杆菌的SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2、针对单核细胞增生性李斯特氏菌的SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4、 针对大肠埃希氏菌0157的SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6、针对金黄色葡萄球菌的SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8、针对志贺氏菌的SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10、针对沙门氏菌SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、针对副溶血性弧菌的 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14。 在其中一个实施例中，还包括有针对细菌内控序列的SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16 〇 本专利技术的主要优点在于： 1.本专利技术所设计的七种食源性致病微生物检测液相芯片具有非常好的信号-噪 声比，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，所设计的扩增引物与tag序列之间不形成 发夹结构、回文结构、不存在特异性结合，anti-tag序列、tag序列以及扩增产物之间不存 在交叉反应，同时，多种标签序列和扩增引物的组合使用本专利技术形成一个检测效果完好的 系统，从而实现多种致病微生物目标基因的并行检测。本专利技术所提供的检测方法与国标法 的吻合率高达1〇〇%。 2.本专利技术设计的扩增引物具有非常好的特异性，能准确区分和特异性扩增各种目 标检测致病微生物相应的基因片段，并通过tag序列与anti-tag序列的特异性结合，实现 七种致病微生物扩增产物的准确区分，而且，本专利技术设计的检测试剂盒，其灵敏度得到极大 提高，从实验结果可知，七种食源性致病微生物的检测灵敏度可达10CFU/mL。 3.本专利技术的检测方法步骤简单，一步多重PCR即可完成多达七种目标微生物中相 关基因目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素， 因而可大大提高检测准确率，体现了精确的定性分析特征。 4.本专利技术所提供的检测方法所需要的时间是4~5小时，远远低于国家标准推荐 的检测方法，特别符合实际检测需要。【具体实施方式】 为了便于理解本专利技术，下面通过具体实施例对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术 可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例 的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。下列实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件，例如Sam本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种食源性致病微生物检测液相芯片试剂盒，其特征在于，包括有：(A)针对待检测微生物基因设计的扩增引物对，每对扩增引物包括有扩增引物F1和扩增引物R1，所述扩增引物F1从5’端至3’端依次由tag序列，间隔臂，每种相应待检测微生物的正向引物组成，所述扩增引物R1为5’端带有生物素标记的、对应的待检测微生物的反向引物；所述tag序列选自SEQ ID NO.17‑SEQ ID NO.28；所述间隔臂选自C3Spacer、Spacer9、dSpacer、3’C6Spacer、Spacer12、Spacer18或PC Spacer中的任一种；所述待检测微生物的正向引物和反向引物包括有以下至少一对：针对阪崎肠杆菌的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、针对单核细胞增生性李斯特氏菌的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、针对大肠埃希氏菌O157的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、针对金黄色葡萄球菌的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、针对志贺氏菌的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、针对沙门氏菌SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、针对副溶血性弧菌的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；(B)包被有Anti‑tag序列的磁珠，所述Anti‑tag序列与相应的待检测微生物的tag序列互补配对，所述Anti‑tag序列选自SEQ ID NO.29‑SEQ ID NO.40；针对不同待检测微生物的磁珠具有不同的荧光编码。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈昌华，陈颖，吴诗扬，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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