食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法及检测盒技术

本发明专利技术公开了一种食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法及多孔检测盒，酶免疫检测用试剂包括抗原包被板Ａ、酶结合物液Ｂ、洗涤液Ｃ、底物Ｄ、显色剂Ｅ、样品稀释液Ｆ、终止剂Ｇ、阳性对照品Ｈ及阴性对照品Ｉ，检测过程使用多孔检测盒，检测过程包括：样本稀释、加样反应、加酶反应和显色反应，抗原包被板Ａ采用快速包被工艺，预先在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗原，酶结合物Ｂ液添加分子量Ｍｒ为２００００、６０００的两种聚乙二醇，解决了现有检测方法操作时间长、操作繁琐、试剂不稳定和配套不完整等问题，具有速度快、操作方便、可靠性高和检测效果好等优点，用于猪囊虫、肺吸虫、肝吸虫和旋毛虫病的酶免疫检测。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法及检测盒。
技术介绍
众所周知，食源性寄生虫病(FOOD SOURCE PARASITEDISEASES)是一组可以通过食物传播的常见寄生虫病，主要包括猪囊虫、肺吸虫、肝吸虫、旋毛虫四种寄生虫病。它们可以感染人体以及家畜，严重损害人类健康并造成畜牧业的经济损失。其中，猪囊虫可以引起癫痫、瘫痪、失明；肺吸虫可以导致肺囊肿、肺脓肿；肝吸虫可以引起胆道感染、胆结石、肝硬化；旋毛虫则可以引起严重的过敏反应及心脏损害。食源性寄生虫流行广泛，仅在中国广东省肝吸虫流行区人口就达到3000万以上。更值得注意的是，食源性寄生虫病的起病隐匿，症状不典型，易与其它疾病混淆，加之目前临床缺乏可靠实用的检测方法，因此，常常被漏诊误诊而贻误病情。目前，食源性寄生虫病的检测方法有两大类一类是传统检测方法，即查找病原体，由于这四种寄生虫多寄生在深部组织内，如脑部、眼球、肝脏胆道、肺部、骨骼肌、心肌等脏器，要通过外科手段采集虫体，不仅损伤甚大而且往往虫体分布散在常难以检获。另外旋毛虫、猪囊虫不排虫卵，肺吸虫排卵很少甚至不排卵；肝吸虫虽可以随粪便排卵，但卵体积微小且排卵不规律，难以检出，临床上常用的粪便涂片法敏感度一般低于50％。因此，无论查虫卵或虫体都不是诊断该组寄生虫病的有效手段；另外一类就是近年来出现的常规酶免疫法等，但这类方法普遍存在以下不足1、操作时间长时间多在长达2-4小时以上，难以适应现场与临床门诊的快速诊断需要；2、试剂操作烦琐如酶结合物和底物液要临时配制，抗原需要过夜包被，样本稀释液体以及终止液体都需要用户自行配制，在应用中给用户带来了诸多不便；3、不稳定所提供的试剂稳定性不佳，一旦配制必须在1周内甚至1天内用完，造成经济损失，也影响了检测的可靠性；4、配套不完整迄今，在市场上尚未见到同时提供方法统一的四种食源性寄生虫成套试剂盒，所有试剂盒都只能测定一种寄生虫病。目前，所见到的供应单位供应品种不齐全，仅供应其中一种或两种，如中国某地一家公司仅提供囊虫检测试剂，同地区另一研究所则仅提供旋毛虫检测试剂。厂家的不同，方法的区别，性能的差异，不仅影响可操作性，更影响到结果的一致性和有效性，容易造成误诊或漏诊，成为食源性寄生虫病防治中一大隐患；5安全隐患常规酶免疫方法常使用具有致畸性作用的OPD作为显色剂，并用强腐蚀性的硫酸作为终止液，对操作人员和环境构成威胁。综上所述，现有的检测技术不能有效满足食源性寄生虫病的诊断需要，不利于疾病的诊断治疗和预防控制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法及与本方法配套用的成套检测盒。为了达到上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案一种食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法，用于猪囊虫、肺吸虫、肝吸虫和旋毛虫的酶免疫检测，该方法的酶免疫检测用试剂包括抗原包被板A、酶结合物液B、洗涤液C、底物D、显色剂E、样品稀释液F、终止剂G、阳性对照品H及阴性对照品I，检测过程使用多孔检测盒，具体过程包括(1)样本稀释用样本稀释液F将待检血清按体积比1∶50稀释，阴阳性对照血清同比例同步稀释，然后(2)加样反应每孔加已稀释血清100ul，同时设阴性、阳性及空白对照各一孔，空白对照孔加入100ul样品稀释液F，37℃静置10分钟，甩去，每孔加洗涤液C一滴，立即用蒸馏水洗涤多次，甩去，拍干，再(3)加酶反应加酶结合物B二滴，37℃反应10分钟，甩去，加洗涤液C一滴，立即用蒸馏水反复洗涤多次，甩去，拍干，最后(4)显色反应加底物D和显色剂E各一滴，混匀，室温下放置2-3分钟，待阴性对照孔微呈蓝色时，加终止剂G一滴混匀，终止反应，肉眼观察浅于近于阴性对照为阴性，呈明显深于阴性对照的蓝色为阳性，用仪器判断以空白对照调零于630nm读取O.D值，待检孔O.D值大于阴性对照2.1倍者为阳性，当阴性对照O.D值低于0.07时按0.07计算。在具体检测过程中，必须注意如下问题1、试剂盒在2-8℃下保存，每次取出时先平衡至室温后使用。滴瓶每次用后一定要将盖拧紧，各瓶盖之间切不可混用；2、洗涤时将蒸馏水加满孔内，每次停放三十秒钟，甩去孔内液体，禁用自来水等其它水源。本专利技术较好的技术方案可以是抗原包被板A采用快速包被工艺，预先在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗原，包被液为含适量抗原的碳酸盐缓冲液(由碳酸氢钠与碳酸钠组成，PH9.60，0.05M)，室温静止12小时，用1％牛血清白蛋白封闭2小时，冷冻真空干燥，真空装袋封口。采用快速包被工艺可以提高工作效率并提高检测的准确率。本专利技术较好的技术方案也可以是酶结合物B液磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.0，0.05M)，添加稳定剂分子量Mr为20000的聚乙二醇重量0.5％-5％，同时添加加速剂分子量Mr为6000的聚乙二醇重量0.5％-5％，加万分之一硫柳汞以及四种寄生虫病统一的抗人免疫球蛋白G辣根过氧化物酶标记结合物。在实施本专利技术的过程中，其它检测用的试剂的成份或配置方法如下洗涤液C采用0.5％吐温的磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.0，0.05M)，加万分之一硫柳汞；底物液D及显色剂E底物液为过氧化氢溶液，显色剂为对人体无害的TMB溶液；样本稀释液F磷酸盐缓冲液(由磷酸二氢钠与磷酸氢二钠组成，PH7.0，0.1M)，含吐温0.5％；终止液G1％十二烷基硫酸钠(SDS)；阳性对照H与阴性对照I阳性对照系将四种阳性病人血清灭活处理，混合，加万分之一硫柳汞分装，成为可以通用的混合阳性对照；阴性对照系若干正常人血清混合后，加万分之一硫柳汞分装保存。以上组分包括了检测所需要的全部试剂(蒸馏水除外)，其中液体组分均已调整到工作浓度并装入塑料滴瓶内，无须稀释可以直接使用；阴阳对照放入带盖的塑料管内，可以直接使用；包被板拆封后也可直接使用。本专利技术较好的技术方案还可以是多孔检测盒是一种可以扣合的四合一化的试剂盒，盒内分为两个区，一个区放置多种寄生虫抗原预包被板，共多块紧邻液体试剂瓶，另一区设置一个开孔纸托或塑料基托立式并行放置多种通用的液体试剂瓶，试剂盒上方有开口，内侧盖上各有一个孔，分别插放阴性和阳性对照血清。实际使用中，用于协调四种抗原包被条件使包括酶结合物在内的其它液体组分可以成为四种寄生虫检测均可直接使用的通用试剂，因此仅一套液体试剂就可以满足四种寄生虫病的检测要求；盒内分为两个区，一个区放置四种寄生虫抗原预包被板，共四块紧邻液体试剂瓶，互相平行站立排列；另一区设置一个开孔纸托或塑料基托立式并行放置6种通用的液体试剂瓶。试剂盒开口设在上面，内侧盖上分别设计一个孔，分别插放阴性和阳性对照血清。与现有技术相比，本专利技术具有以下明显的优点1、提高了反应速度，整个反应时间不超过30分钟。比常规酶免疫方法提高了4倍以上；2、方便实用试剂盒不仅配备了检测所必须的试剂组分，而且均为即开即用型，用户不必另行配制或稀释，使操作简单易行。不仅可以用仪器定量判断结果，也可以肉眼直接判断，尤适合于条件受限的现场普查和门诊检测；3、提高了四种疾病检测的可靠性由于统一了操作方法和液体试剂，使得用户可以在同一时间和方法下进行操作，使得结果具有高度的一致性和可比性；4、安全环保；采用了无害的TMB试剂，避免了常规方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法，用于猪囊虫、肺吸虫、肝吸虫和旋毛虫病的酶免疫检测，其特征在于：酶免疫检测用试剂包括抗原包被板Ａ、酶结合物液Ｂ、洗涤液Ｃ、底物Ｄ、显色剂Ｅ、样品稀释液Ｆ、终止剂Ｇ、阳性对照品Ｈ及阴性对照品Ｉ，检测过程使用多孔检测盒，具体过程包括：（１）样本稀释：用样本稀释液Ｆ将待检血清按体积比１∶５０稀释，阴阳性对照血清同比例同步稀释，然后（２）加样反应：每孔加已稀释血清１００ｕｌ，同时设阴性、阳性及空白对照各一孔，空白对照孔加入１００ｕｌ样品稀释 液Ｆ，３７℃静置１０分钟，甩去，每孔加洗涤液Ｃ一滴，立即用蒸馏水洗涤多次，甩去，拍干，再（３）加酶反应：加酶结合物Ｂ二滴，３７℃反应１０分钟，甩去，加洗涤液Ｃ一滴，立即用蒸馏水反复洗涤多次，甩去，拍干，最后（４）显色反应：加底物Ｄ和 显色剂Ｅ各一滴，混匀，室温下放置２－３分钟，待阴性对照孔微呈蓝色时，加终止剂Ｇ一滴混匀，终止反应，肉眼观察浅于近于阴性对照为阴性，呈明显深于阴性对照的蓝色为阳性，用仪器判断：以空白对照调零于６３０ｎｍ读取０．Ｄ值，待检孔０．Ｄ值大于阴性对照２．１倍者为阳性，当阴性对照０．Ｄ值低于０．０７时按０．０７计算。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡绍良，
申请(专利权)人：胡绍良，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]