基于油菜子叶叶绿体转化的组织培养体系及获得转化植株的方法技术

本发明专利技术属于植物转基因技术领域。具体涉及一种甘蓝型油菜转基因的方法。本发明专利技术建立了适合以油菜子叶为外植体的叶绿体转化组织培养体系，通过基因枪转化法获得油菜叶绿体转基因植株。本发明专利技术还公开了利用油菜叶绿体片段为同源重组片段，构建油菜叶绿体特异性表达载体，对油菜叶绿体进行转化并获得转基因植株的方法。本发明专利技术为甘蓝型油菜的转基因提供了一种新途径。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种利用基因枪方法培育油菜叶绿体转基因的方法，其步骤包括培养基制备，引物设计、ＰＣＲ扩增、载体构建和遗传转化，其特征在于，以油菜子叶为外植体，通过基因枪法将油菜叶绿体特异性表达载体导入受体油菜中，通过筛选及鉴定，得到叶绿体转化植株，其步骤如下：１）引物设计和载体构建：根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ公布的拟南芥叶绿体基因组序列（登录号为ＮＣ０００９３２），设计两对特异引物对Ｆ－ｔｒｎＩ、Ｒ－ｔｒｎＩ、Ｆ－ｔｒｎＡ和Ｒ－ｔｒｎＡ，以油菜叶绿体基因组为模板，用所述的引物对Ｆ－ｔｒｎＩ、Ｒ－ｔｒｎＩ、Ｆ－ｔｒｎＡ和Ｒ－ｔｒｎＡ扩增ｔｒｎＩ和ｔｒｎＡ基因片段，测序后作为同源重组片段，从质粒ｐ－ａａｄＡ中分别用ＳｍａＩ和ＥｃｏＲＶ酶切获得筛选标记基因ａａｄＡ，其序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｘ所示，调控序列，其序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｙ所示，从质粒ｐ－Ｐｒｒｎ中分别用ＳｐｅＩ和ＸｈｏＩ酶切获得启动子Ｐｒｒｎ，从质粒ｐ－ＴｐｓｂＡ中分别用ＳｍａＩ和ＥｃｏＲＶ获得终止子ＴｐｓｂＡ，将所述的同源重组片段、启动子、筛选标记基因和终止子连接到载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ上，构建得到油菜叶绿体特异性表达载体ｐＣＬ３１８－５；所述的特异引物对Ｆ－ｔｒｎＩ、Ｒ－ｔｒｎＩ、Ｆ－ｔｒｎＡ和Ｒ－ｔｒｎＡ的ＤＮＡ序列如下所示：Ｆ－ｔｒｎＩ：５’－ＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＡＣＴＧ－３’，Ｒ－ｔｒｎＩ：５’－ＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣ－３’；Ｆ－ｔｒｎＡ：５’－ＡＴＡＧＴＣＧＡＣＧＧＧＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＡＧＴＴＧＧ－３’，Ｒ－ｔｒｎＡ：５’－ＴＡＡＧＧＧＣＣＣＣＧＧＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＧ－３’；２）应用基因枪方法转化油菜子叶，它包括以下步骤：１）外植体的获得：取饱满油菜种子经表面消毒后接种至Ｂ５基本培养基上，在２５℃，２０００Ｌｕｘ，１６ｈ光照／８ｈ黑暗条件下生长４ｄ，然后将子叶切下，黑暗条件下高渗？预处理４ｈ；２）基因枪转化及筛选：将步骤１）的油菜子叶，进行基因枪轰击，每皿轰击２次，轰击后在黑暗条件下用Ｂ５培养基中恢复培养１６ｈ；３）愈伤组织的诱导及筛选：将恢复培养后的油菜子叶切成３ｍｍ×３ｍｍ的块状，转入附加１０ｍｇ／ｌ壮观霉素的愈伤诱导培养基Ｂ５Ｄ－５Ｓ上，于２５℃，２０００Ｌｕｘ，１６ｈ光照／８ｈ黑暗条件下诱导愈伤组织，每两周继代培养一次，共继代培养４次；４）愈伤组织的分化诱导：将步骤３）...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉才，李和平，程琳，傅庭栋，瞿波，黄涛，涂金星，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]