一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法技术

本发明专利技术提供了一种人类血管内皮细胞培养液，包括有基础培养基，还包括胎牛血清、人重组表皮生长因子、人重组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、维生素C、皮质醇、霍乱毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺；本发明专利技术的人类血管内皮细胞培养液，相对于传统血管内皮细胞培养基，能够适用于多种血管内皮细胞，有效促进细胞增殖和减小分裂时间，维持血管内皮细胞的性状，大大增加了体外人类血管内皮细胞的传代数和生存时间；同时本发明专利技术的细胞培养液各个组分一般实验室均可以获得，配制方便，无需使用成品专用培养基，大大降低了培养内皮细胞的成本，适合推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法。
技术介绍
血管内皮细胞不仅参与调解血管通透性和凝血过程，还在免疫调解，移植排斥，肿瘤转移，炎症等许多过程中也具有重要作用。在科研中常采用体外培养的方法来对血管内皮细胞进行研究。由于目前大多数人仍不承认使用永生化的血管内皮细胞系，故目前常规仍用从人身上纯化血管内皮细胞研究。而血管内皮细胞的培养，常常细胞增殖慢，细胞数代以后性状发生改变，或者死亡，使研究成本变大，研究时间拉长。血管内皮细胞体外培养对于培养基营养要求较高，而提高生长速度，增加传代次数，维持传代后细胞性状对于利用血管内皮细胞体外研究多种疾病的显得尤其重要。目前市场上比较成熟的内皮细胞培养基主要有Lonza公司的EGM和EGM-2系列，以及Sciencell的ECM培养基，上述培养基在体外培养正常人脐静脉内皮细胞和人微血管内皮细胞都有相对不错的效果，但配方保密且价格昂贵。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的一种能够适用于多种血管内皮细胞(包括原代细胞和细胞株)，并且有效促进细胞增殖，减小分裂时间，同时成本相对低廉的人类血管内皮细胞培养液。为了实现上述技术目的，本专利技术所采用的技术措施为：一种人类血管内皮细胞培养液，包括有基础培养基，还包括胎牛血清、人重组表皮生长因子、人重组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、维生素C、皮质醇、霍乱毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，上述基础培养基选自DMEM培养基、DMEM/F12培养基、M199培养基及Williams’s E培养基，或者其他任何适用的贴壁培养基；优选地，上述培养液中还包括防污染组分、L-谷氨酰胺及肝素；进一步地，上述防污染组分选自青霉素、链霉素氨和两性霉素B的一种或几种；优选地，本专利技术的培养液在每100ml的基础培养液中包含：胎牛血清 10-20ml青霉素 10000U链霉素 10000UL-谷氨酰胺 1.25-1.5ml肝素 2-20mg人重组表皮生长因子 10-1000ng人重组成纤维细胞生长因子 100-2000ng血管内皮生长因子 10-100ng胰岛素样生长因子 0.1-5μg维生素C 10-200μg皮质醇 10-200μg霍乱毒素 1-80μg氨基乙醇 6.108-61.08 μg磷酸乙醇胺 14.106-141.06 μg；上述的各组分和比例可以进一步优选为，每100ml的DMEM/F12培养液中包含：胎牛血清 10ml青霉素 10000U链霉素 10000UL-谷氨酰胺 1.25ml肝素 9mg人重组表皮生长因子 500ng人重组成纤维细胞生长因子 1000ng血管内皮生长因子 50ng胰岛素样生长因子 2μg维生素C 100μg皮质醇 100μg霍乱毒素 10μg氨基乙醇 30.54μg磷酸乙醇胺 70.53μg。另一方面，本专利技术还提供一种相应的人类血管内皮细胞的分离培养方法，，包括以下步骤：步骤一，利用新鲜离体新生儿脐带分离得到脐静脉；步骤二，使用预热的冲洗液对脐静脉进行冲洗灌流；步骤三，利用预热的消化液对步骤二处理后的脐静脉进行灌流消化；步骤四，收集灌流消化液，进行离心洗涤，然后使用基础培养基进行重悬并再次离心，最后利用本专利技术上述的细胞培养液再次重悬，分离得到人类血管内皮细胞；步骤五，将分离得到的人类血管内皮细胞使用本专利技术上述细胞培养液稀释，接入细胞板或细胞瓶，使用本专利技术上述的细胞培养液进行培养。为了进一步优化上述的人类血管内皮细胞的分离培养方法，上述步骤二中预热的冲洗液可以优选为37℃预热的D-hanks溶液、PBS溶液或基础培养液；上述步骤三中预热的消化液可以优选为37℃预热的含有II型胶原酶或IV型胶原酶的D-hanks溶液；上述步骤五中的培养条件优选为37±1℃，5% CO2，湿度为90%±2%。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：首先，本专利技术的人类血管内皮细胞培养液，相对于传统血管内皮细胞培养基，能够适用于多种血管内皮细胞，包括原代细胞和细胞株，同时可以有效促进细胞增殖和减小分裂时间；其次，本专利技术的细胞培养液中各个生长因子及组分的配合添加，能够有效地维持了血管内皮细胞的性状，在体外扩充了10代以后，细胞仍能有较大程度维持原有性状，大大增加了体外人类血管内皮细胞的传代数和生存时间；再次，本专利技术的细胞培养液各个组分一般实验室均可以获得，配制方便，无需使用成品专用培养基，大大降低了培养内皮细胞的成本；最后，本专利技术使用的内皮细胞分离培养方法开创新的使用灌流清洗和灌流消化的方式，使得分离得到的细胞分离度高，污染小，细胞活力和活率更高。附图说明图1为实施例一中利用本专利技术的培养基与对照培养基培养人脐静脉内皮原代细胞（HUVEC）传5代与10代的细胞形态学比较图。图2为实施例一中利用本专利技术的培养基与对照培养基培养人脐静脉内皮原代细胞5代至9代平均传代时间的比较图；图3为实施例一中本专利技术培养基与对照培养基培养人脐静脉内皮原代细胞5代与10代后的细胞活率比较图。图4为实施例一中利用本专利技术的培养基与对照培养基培养人脐静脉内皮原代细胞经冻存复苏后传5代与10代后的细胞纯度比较。图5为实施例二中利用本专利技术的培养基与对照培养基培养人微血管内皮细胞HMEC-1传30代与50代后细胞形态学比较图。图6为实施例二中利用本专利技术的培养基与对照培养基培养人微血管内皮细胞HMEC-1传20代至40代平均传代时间的比较图；图7为实施例二中利用本专利技术培养基与对照培养基培养人微血管内皮细胞HMEC-1 20代，35代与50代后的细胞活率比较图。图8为实施例二中利用本专利技术培养基与对照培养基培养人微血管内皮细胞HMEC-1 20代后不同培养天数细胞的收获量比较图。具体实施方式本专利技术提供了一种人类血管内皮细胞培养液，包括有基础培养基，还包括胎牛血清、人重组表皮生长因子、人重组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类血管内皮细胞培养液，包括有基础培养基，其特征在于，还包括胎牛血清、人重组表皮生长因子、人重组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、维生素C、皮质醇、霍乱毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺。

【技术特征摘要】
1.一种人类血管内皮细胞培养液，包括有基础培养基，其特征在于，还包括胎牛血清、人重组表皮生长因子、人重组成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、维生素C、皮质醇、霍乱毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺。2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM培养基、DMEM/F12培养基、M199培养基及Williams’s E培养基。3.根据权利要求2所述的细胞培养液，其特征在于，还包括防污染组分、L-谷氨酰胺及肝素。4.根据权利要求3所述的细胞培养液，其特征在于，所述防污染组分选自青霉素、链霉素氨和两性霉素B的一种或几种。5.根据权利要求4所述的细胞培养液，其特征在于，每100ml的基础培养液中包含：胎牛血清 10-20ml青霉素 10000U链霉素 10000UL-谷氨酰胺 1.25-1.5ml肝素 2-20mg人重组表皮生长因子 10-1000ng人重组成纤维细胞生长因子 100-2000ng血管内皮生长因子 10-100ng胰岛素样生长因子 0.1-5μg维生素C 10-200μg皮质醇 10-200μg霍乱毒素 1-80μg氨基乙醇 6.108-61.08 μg磷酸乙醇胺 14.106-141.06 μg。6.根据权利要求5所述的细胞培养液，其特征在于，每100ml的DMEM/F12培养液中包含：胎牛血清 10ml青霉素 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆介元，姚茜茜，吴晶，
申请(专利权)人：上海瑞鹿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31