本发明专利技术涉基因工程技术及器官修复重建领域，具体涉及一种通过基因改造血管内皮细胞促进创面愈合的方法及其应用。本发明专利技术构建了Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞，实验发现，Nogo-B下调后脐静脉血管内皮细胞本身增殖减慢，但可以明显促进创面愈合。本发明专利技术可提高创面愈合的速度，为创面愈合或创面覆盖物的改进提供一定的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉基因工程技术及器官修复重建领域，具体涉及一种通过基因改造血管内 皮细胞促进创面愈合的新方法，及其将该方法应用于制备皮肤移植物促进创面愈合。
技术介绍
创面愈合是一种涉及多种细胞及分子的复杂过程，主要包括炎症期、增生期和重 塑期三个阶段。伤口愈合的第一个时期是炎症期，伤口形成后伤口或组织裂隙内为血凝块 所充填，其周围组织发生急性炎症，各种炎症介质的释放和炎症细胞浸润使伤口表现为 红、肿、热、痛，在这一过程中，纤维细胞、肌成纤维细胞于伤后6h在伤口边缘出现，24~48h 有血管内皮细胞增生，逐渐形成新生毛细血管。增生期成纤维细胞、内皮细胞和新生毛细血 管共同构成肉芽组织充填裂隙，同时肉芽组织内胶原纤维逐渐增多，使得其硬度与张力强 度随之增加，逐渐变为纤维组织架接于断裂的组织之间，即瘢痕修复；同时上皮细胞、成骨 细胞和成软骨细胞等增生，使伤口边缘皮肤新生上皮，直到伤口初步愈合。在塑形期，随着 机体状态的好转和活动恢复，通过各种酶的作用和运动应力作用，调整瘢痕组织内的胶原 纤维含量和排列，使其软化而不影响张力强度，从而适应生理功能，至此伤口修复过程遂告 完成。在这相互交错的3个过程中，炎症反应、血管通透性、伤口血管化以及肉芽组织生长 和上皮细胞增殖都是影响到伤口愈合的重要因素。 关于创面移植干细胞促进创面愈合的研究有很多，其治疗作用主要是通过发挥旁 分泌和免疫调节功能，调控组织周同相关细胞以及改善微环境等作用参与修复和重建。 近年来的研究表明慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而 达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细 胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因修饰与治疗的效果。在美 国已经开展了慢病毒介导的基因治疗的临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前 景（Dong A, Rivella S, Breda L. Gene therapy for hemoglobinopathies:progress and challenge. Transl Res. 2013 Jan 18.pii:S1931-5244(12)00447-1·)。 Nogo基因是近些年来发现的新基因，目前发现Nogo基因编码的三种蛋白：Nogo A、Nogo B和Nogo C，均是中枢神经系统髓鞘中具有抑制神经生长活性的跨膜蛋白。目前 研究发现，Nogo-B与肿瘤抑制、凋亡、神经系统再生抑制、血管内膜损伤修复等多种病理 生理过程有不同程度的关系。其在血管内皮细胞和平滑肌细胞中高表达，有促进内皮细 胞迀移和抑制平滑肌细胞的功能，在损伤再生和血管修复重塑方面发挥重要作用。（参见 文南犬：Lili Gao, TeruoUtsumi, KeitaroTashiro, etc. Reticulon 4B (Nog〇-B)Facilitates Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 2013Mar ； 57 (5):1992-2003. ；Annarita Di Lorenzo, Thomas D. Manes,AlbertoDavalos,etc. Endothelial reticulon_4B (Nogo_B)regulatesICAM-1 - mediated leukocyte transmigration and acute inflammation. Blood. 2011, 117(7) :2284 - 95 ；Jun Yu，Car losFernandez-Hernando, YajairaSuarez, etc. Reticulon 4B(Nogo~B)isnecessary for macrophage infiltration and tissue repair. PNAS, 2009, 106(41):17511-17516)〇 基因修饰可调节细胞增殖，并调节细胞分泌生长因子参与创面愈合。目前较为安 全的基因修饰方法是慢病毒感染。慢病毒基因载体是由I型人免疫缺陷病毒改造的新型病 毒载体，作为一种高效的基因转染载体应用越来越广泛，经多次修饰改造其转导效率和安 全性都得到了保证。目前尚无文献报道有关Nogo-B基因修饰人脐静脉血管内皮细胞，以促进人创面 愈合的研究及应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供跨膜蛋白Nogo-B的新用途；本专利技术的另一目的在于提供 一种促进创面愈合的方法；以及该方法在制备皮肤移植物中的应用。 本专利技术的构思如下： 申请人基于Nogo-B可调节内皮细胞迀移，抑制平滑肌细胞等实验依据，构建含目 的基因 Nogo-B特定干扰序列的慢病毒干扰载体，将其转染人脐静脉血管内皮细胞，获得 Nogo-B低表达的脐静脉血管内皮细胞，称之为HUVEC-siNogoB，将其注射至裸鼠全层创面 周围，观察其创面愈合情况。并通过冰冻切片证明细胞在创面存活情况，体外实验检测其自 身血管成环情况以及对成纤维细胞增殖迀移的影响。 本专利技术的主要技术方案如下：首先是根据Nogo-B的基因结构，设计RNA干扰 序列，构建Nogo-BRNAi慢病毒载体。通过查阅文献确定Nogo-B基因特定的干扰序列 为：CAGAATCTATGGACTGAAT (Jun Yu, CarlosFernandez-Hernando, YajairaSuarez, etc. Reticulon 4B(Nogo-B)isnecessary for macrophage infiltration and tissue repair. PNAS, 2009, 106 (41) : 17511-17516)。构建 Nogo-BRNA 干扰的慢病毒载体为：GV248-Nog〇-B RNAi-GFP，将Nogo-B的干扰慢病毒感染人脐静脉血管内皮细胞。 最后，本专利技术将GV248-Nogo_B RNAi-GFP颗粒感染脐静脉血管内皮细胞（HUVEC)， 实验发现，Nogo-B下调后脐静脉血管内皮细胞本身增殖减慢，但可以明显促进创面愈合。 本专利技术的第一方面，提供了跨膜蛋白Nogo-B在制备（皮肤）创面愈合（修复）药 物或试剂中的应用。 所述的药物或试剂为降低跨膜蛋白Nogo-B的表达量的药物或试剂。 所述的药物或试剂包含以下任一： A)含有跨膜蛋白Nogo-B干扰序列的重组载体； B)含有跨膜蛋白Nogo-B干扰序列的重组病毒； C)跨膜蛋白Nogo-B低表达的血管内皮细胞； Nogo-B 的 GENBANK 号：NG_029037. 1 所述的干扰序列为Nogo-B的siRNA、shRNA等。 优选的，所述的跨膜蛋白Nogo-B干扰序列，如下： CAGAATCTATGGACTGAAT (SEQ ID N0:1) 其中B)，优选为，含有跨膜蛋白Nogo-B干扰序列的慢病毒； 慢病毒载体的构建方法可以选用本领域常规方法，例如参见：耿运琪主编，慢病毒 与泡沫病毒分子生物学文选，南开大学出版社。 在本专利技术的一个优选实施例中，所用的慢病毒载体为GV248,构建获得的 Nog本文档来自技高网...
【技术保护点】
跨膜蛋白Nogo‑B在制备创面愈合药物或试剂中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王星童，李恒宇，郑勇军，吴海斌，田松，仵敏娟，罗鹏飞，王亮，肖仕初，朱世辉，夏照帆，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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