一种新型血管内皮细胞疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种含佐剂的血管内皮细胞疫苗及其制备方法，是用异种动物人、鼠、牛内皮细胞作为血管内皮细胞来源并联合佐剂OK432，制备血管内皮细胞疫苗，作为抗原免疫，激发机体免疫系统，对肿瘤血管产生免疫应答。具体制备方法是用人或其它血管内皮细胞株，用含有5％胎牛血清、1％ECGS、青霉素和链霉素的DMEM培养基培养，扩增后经收集、洗涤制成细胞悬液，体外与佐剂OK432混合，即制备出该新型血管内皮细胞疫苗。动物实验结果表明：该内皮细胞疫苗能抑制小鼠多种肿瘤的生长。病理切片表明：该血管内皮细胞疫苗对小鼠的主要脏器，如心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均无毒性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于疫苗领域，具体涉及即利用血管内皮细胞及佐剂制备异种免疫疫苗。
技术介绍
当今世界，肿瘤是威胁人类健康的主要杀手之一。目前，外科手术、化学治疗和放射治疗是肿瘤治疗的三种主要手段。肿瘤的发生是一个多步骤、多环节、多层次的复杂的过程，使这些方法的疗效受到限制。手术治疗作为当前最有效的治疗方案，尽管能有效去除肉眼可见的肿瘤，但不能保证所有的肿瘤细胞都被切除，故而术后复发的问题严重。放化疗有严重的毒副作用，以及许多肿瘤对其不敏感，存在不同程度的耐药性，故降低了放化疗的疗 效。自从Judah Folkman提出肿瘤生长和转移依赖于新生血管形成这一理论假说，抗肿瘤血管生成治疗已经成为肿瘤治疗的热点。抗血管疗法具有药物容易达到祀细胞，不易产生耐药性，抗瘤谱广泛，毒副作用小，以及与化疗、放疗及放射免疫疗法存在联合增效的优点。大量的靶向肿瘤血管新生的多肽类药物以及单克隆抗体已经在临床前以及临床实验中显示了强大的抗肿瘤效果，并且有一些祀向肿瘤血管新生药物，例如Avastin、Endostar等药物已经被批准上市，成为癌症临床治疗的有效补充。然而，蛋白多肽类药物生物半衰期短，为达到有效抗肿瘤效果，药物需在短时间内大量服用，这导致了一定程度上的毒副作用。近年来随着肿瘤免疫治疗的不断发展，应用自体或异体的内皮细胞作疫苗，利用主动免疫的方式来诱导机体产生靶向肿瘤血管的体液免疫和细胞免疫，能达到良好的抗肿瘤效果，并且这一方案可以避免因蛋白多肽类药物短期大量服用而造成的毒副作用。本专利技术的新型血管内皮细胞疫苗，是用异种动物人、鼠、牛内皮细胞作为血管内皮细胞来源，并联合佐剂0K432，制备血管内皮细胞疫苗，作为交叉抗原异种免疫，激发机体免疫系统，对肿瘤中的新生血管产生免疫应答。0K432作为免疫活性增强剂，具有激活多种免疫效应细胞的作用，可安全有效地提高恶性肿瘤患者的生存率，延长存活期。在日本，0K432作为抗肿瘤的辅助用药已被广泛应用于临床，临床用药显示具有良好的效果。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种含佐剂的内皮细胞疫苗，包括内皮细胞抗原以及佐剂。本专利技术通过引入佐剂0K432增加了内皮细胞疫苗的免疫原性，以诱发机体产生更有效的免疫反应，从而为临床上肿瘤手术后的预防和治疗提供有效的辅助措施，可以有效延长患者的生存期，提高生活质量。本专利技术的血管内皮细胞疫苗，是用异种动物人、鼠、牛内皮细胞作为血管内皮细胞来源，并联合佐剂0K432，制备血管内皮细胞疫苗，作为交叉抗原异种免疫，激发机体免疫系统，对肿瘤的新生血管产生免疫应答。血管内皮细胞疫苗的制备方法血管内皮细胞可来源于体外培养的人、鼠、牛血管内皮细胞株，如用人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)制备内皮细胞疫苗，用ECM内皮细胞专用培养基，置于含5% C02，37 °C培养箱中培养，收集扩增后的HUVEC于离心管中，PH 7. 2磷酸盐缓冲液洗涤三次，O. 9%生理盐水重悬细胞制成细胞悬液，计数板计数后，用O. 9%生理盐水稀释至5 X 10Vml。取Iml细胞悬液溶解O. 5KE佐剂OK432，充分混合，即制成新型血管内皮细胞疫苗HUVEC-OK432。抑制肿瘤中的血管生成，阻断肿瘤生长所需的氧气和营养物质供应，可以抑制肿瘤的发生、发展和转移。我们制备出的内皮细胞疫苗。作为交叉抗原异种免疫激发机体免疫系统对肿瘤血管产生免疫应答， 通过体液免疫和细胞免疫多种途径破坏肿瘤新生血管，抑制肿瘤生长，造成肿瘤新生血管病理性损伤，其抗肿瘤效果大大强于抗血管生成治疗的药物，并且可以克服大量服用抗血管生成治疗药物导致的毒副作用。附图说明图I是本专利技术的新型血管内皮细胞疫苗的制备工艺流程图。图2显示了 H&E染色结果；显示出新型血管内皮细胞疫苗HUVEC-0K432对小鼠脏器，如心肝脾肺肾等无毒性，说明此疫苗是安全的。其中，a PBS ；b HUVEC-0K432 ；1 :心脏；2:肝脏；3:脾脏；4:肺脏；5:肾脏。图3本专利技术的新型血管内皮细胞疫苗HUVEC-0K432针对H22肝癌的动物预防免疫试验结果；其中，a PBS ；b 0K432 ；c HUVEC ；d :HUVEC_0K432。图4本专利技术的新型血管内皮细胞疫苗HUVEC-0K432针对B16F10黑色素瘤的动物预防免疫试验结果；其中，a PBS ；b 0K432 ；c =HUVEC ；d :HUVEC_0K432。图5本专利技术的新型血管内皮细胞疫苗HUVEC-0K432针对EAC乳腺癌的动物预防免疫试验结果；其中，a PBS ；b 0K432 ；c HUVEC ；d :HUVEC_0K432。具体实施例方式本专利技术提供了一种新型血管内皮细胞疫苗的制备方法，该方法的制备工艺流程见图I。佐剂0K432在这种新型内皮细胞疫苗中的作用是0K432作为免疫活性剂，可以增强多种免疫细胞的活性，刺激淋巴细胞后，显示出LAK细胞活性，既获得淋巴细胞能够抗多种肿瘤，甚至对抗NK细胞的瘤细胞都表现出较好的活性。0Κ432也参与诱导产生CTL细胞。诱导一些细胞因子的表达与释放，如IL-2、IFN-y等。新型内皮细胞疫苗的制备方法如下血管内皮细胞可来源于体外培养的人、鼠、牛血管内皮细胞株，如用人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)制备内皮细胞疫苗，用ECM内皮细胞专用培养基，置于含5% C02，37°C培养箱中培养，收集扩增后的HUVEC细胞于离心管中，PH 7. 2磷酸盐缓冲液洗涤三次，O. 9%生理盐水重悬细胞制成细胞悬液，计数板计数后，用O. 9%生理盐水稀释至5 X 10Vml。取Iml细胞悬液溶解O. 5KE佐剂0K432，充分混合，即制成新型血管内皮细胞疫苗HUVEC-0K432。在本专利技术的第二方面是含佐剂的内皮细胞疫苗的用途，如上所述，在临床上，用本专利技术所述的含佐剂内皮细胞疫苗有望对肿瘤患者进行有效的辅助治疗，延长患者生存期，改善生活质量。现结合以下实例更加详细的描述本专利技术的新型内皮细胞疫苗制备方法及其应用。提供这些实例的目的仅在于示范性的说明本专利技术，不能将其理解为是对本专利技术的范围和实质的限制。材料⑴细胞株人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)，购自北京裕恒丰科技有限公司。(2)酶和试剂胰酶，购自上海生工。0K432，购自广州百济抗肿瘤药房。(3)培养基ECM内皮细胞专用培养基，购自北京裕恒丰科技有限公司。实施例I :HUVEC-0K432 疫苗制备血管内皮细胞可来源于体外培养的人、鼠、牛血管内皮细胞株，如用人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)制备内皮细胞疫苗，用ECM内皮细胞专用培养基，置于含5% C02，37°C培养箱中培养，收集扩增后的HUVEC细胞于离心管中，pH 7. 2磷酸盐缓冲液洗涤三次，O. 9%生理盐水重悬细胞制成细胞悬液，计数板计数后，用O. 9%生理盐水稀释至5X 107/ml。取Iml细胞悬液溶解O. 5KE佐剂0K432，充分混合，即制成新型血管内皮细胞疫苗HUVEC-0K432。实施例2 HUVEC-0K432疫苗安全性评价选用6-7周龄BALB/c小鼠12只，疫苗组和对照组均为6只，体重20_25g。按照免疫计划于O周每只小鼠皮下注射100 μ L疫苗和PBS。以后每隔两周加强免疫一次，共进行2次加强免疫。第三次本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含佐剂的新型血管内皮细胞疫苗，其特征在于：包括内皮细胞抗原以及佐剂，作为交叉抗原异种免疫，激发机体免疫系统对肿瘤血管产生免疫应答。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李泰明，徐茂磊，肖雯，刘景晶，吴洁，曹荣月，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：