本发明专利技术涉及干细胞分离培养技术领域，特别涉及一种脐带静脉内皮细胞的原代分离培养方法及其试剂盒。该方法包括：将酶解液灌注入脐带静脉，酶解，收集脐带静脉内皮细胞；用完全培养基培养脐带静脉内皮细胞；酶解液的配方为含有II型胶原酶和透明质酸酶的基础培养基。本发明专利技术提供的脐带静脉内皮细胞的原代分离培养方法操作步骤简单，细胞获取率高，细胞活率高，大大缩短了原代培养周期。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞分离培养
，特别涉及一种脐带静脉内皮细胞的原代分 离培养方法及其试剂盒。
技术介绍
血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块。在可变 的流体依赖型中，血栓由不溶性纤维蛋白、沉积的血小板、积聚的白细胞和陷入的红细胞组 成。血栓形成是由一组遗传和环境因素相互作用、相互影响的多因素变化过程。临床常见 的血栓患者，最主要的特点有家族遗传性，反复发作性，症状严重性，血栓形成部位异常性， 以及发病时间年轻化。形成机理包括： 一、心、血管内膜损伤 (1)内膜受到损伤时，内皮细胞发生变性、坏死脱落，内皮下的胶原纤维裸露，从而 激活内源性凝血系统的M因子，内源性凝血系统被激活。 ⑵损伤的内膜可以释放组织凝血因子，激活外源性凝血系统。 ⑶受损伤的内膜变粗糙，使血小板易于聚集，主要黏附于裸露的胶原纤维上。 二、血流改变 血流变慢和血流产生漩涡等。 三、血液性质改变 主要是指血液凝固性增高，见于血小板和凝血因子增多。如在严重创伤、产后及大 手术后。 正常的血管内皮细胞在维持血管壁的完整性、调节微血管通透性和血液的流动性 等方面具有重要作用。内皮细胞不仅有较强的抗血栓作用，参与血栓的溶解过程，而且具有 重要的代谢功能：如灭活某些血管活性物质、摄取脂蛋白等。因而内皮细胞损伤可能是血栓 形成、动脉粥样硬化及脏器、组织水肿的重要原因。因此，成功建立血管内皮细胞系，为体外 研宄大血管内皮细胞功能的提供重要的研宄载体。 目前，酶解液灌注法是获取血管内皮细胞的主要方法，但现有的酶解液灌注法存 在一定的缺陷： (1)采用单酶酶解法，酶解时间长，且获取的内皮细胞数量较少、活力低； (2)培养体系仅是M199+10%FBS，添加适量的抗生素，不能为刚酶解细胞提供充 足的营养成分，原代培养周期过长； (3)酶解时间长，获取的不同类型的细胞种类，不利于传代后的细胞纯化。 基于上述存在的问题，急需一种能够提高内皮细胞提取效率及存活率的原代分离 培养方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种脐带静脉内皮细胞的原代分离培养方法及其试剂 盒。该方法操作步骤简单，细胞获取率高，细胞活率高。此外，本专利技术优化了培养体系，大大 缩短了原代培养周期。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案： 本专利技术提供了一种脐带静脉内皮细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤： 将酶解液灌注入脐带静脉，酶解，收集脐带静脉内皮细胞； 用完全培养基培养脐带静脉内皮细胞； 酶解液的配方为含有II型胶原酶和透明质酸酶的基础培养基。 本专利技术创造性的采用了双酶灌注法提取脐带静脉内皮细胞，该方法操作步骤简 单，细胞获取率高，细胞活率高。此外，本专利技术优化了培养体系，大大缩短了原代培养周期。作为优选，酶解的温度为36~38°C，酶解的时间为5~15min。优选地，酶解的温度为37°C，酶解的时间为lOmin。 作为优选，II型胶原酶的浓度为0? 01%~0? 1%，酶活力为彡125⑶U/mg。 优选地，II型胶原酶的浓度为0? 1 %，酶活力为125⑶U/mg。 作为优选，透明质酸酶的浓度为0.01%~0? 1%，酶活力彡10万U/g。 优选地，透明质酸酶的浓度为0.01%~0? 1%，酶活力为10万U/g~25万U/g。 优选地，透明质酸酶的浓度为〇? 1 %，酶活力为10万U/g。 作为优选，培养的温度为37°C，培养的时间为48h。 在本专利技术提供的一些实施例中，完全培养基为含有1 %~5%谷氨酰胺和/或 1 %~5%非必需氨基酸的完全培养基。 作为优选，完全培养基为含有1 %谷氨酰胺和1 %非必需氨基酸的完全培养基。 在本专利技术提供的一些实施例中，培养的细胞密度为1X105~10X105cell/mL。 作为优选，培养的细胞密度为5X105cell/mL。 作为优选，基础培养基为DMEM高糖基础培养基。 作为优选，完全培养基为Lonza完全培养基。 在本专利技术提供的一些实施例中，将酶解液灌注入脐带静脉之前还包括对脐带静脉 清洗的步骤。 在本专利技术提供的一些实施例中，清洗采用灌洗液进行清洗，灌洗液为含有IX~ 3X青-链霉素和/或0. 01%~0. 04%EDTA的PBS。 作为优选，清洗采用灌洗液进行清洗，灌洗液为含有IX青-链霉素和0. 02% EDTA的PBS。 在本专利技术提供的一些实施例中，在采用灌洗液对脐带静脉清洗之前还包括采用脐 带保存液保存脐带的步骤，脐带保存液为含有IX~3X青-链霉素、50mg~100mg/mL乳 糖醛酸、1 %~5 %羟乙基淀粉、5 %脐血浆的生理盐水。 本专利技术还提供了一种脐带静脉内皮细胞原代分离培养试剂盒，包括完全培养基、 基础培养基、II型胶原酶和透明质酸酶，所述完全培养基为含有谷氨酰胺和/或非必需氨 基酸的完全培养基。 作为优选，II型胶原酶的酶活力为彡125⑶U/mg。 优选地，II型胶原酶的酶活力为125⑶U/mg。 作为优选，透明质酸酶的酶活力为10万U/g~25万U/g。 优选地，透明质酸酶的酶活力为10万U/g。在本专利技术提供的一些实施例中，完全培养基为含有1%~5%谷氨酰胺和/或 1 %~5%非必需氨基酸的完全培养基。作为优选，完全培养基为含有1%谷氨酰胺和1%非必需氨基酸的完全培养基。作为优选，非必需氨基酸为谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、 丝氨酸或酪氨酸中的一种或两者以上的混合物。在本专利技术提供的一些实施例中，非必需氨基酸购买于Gibco公司。 作为优选，基础培养基为DMEM高糖基础培养基。酶解液中采用DMEM高糖基础培 养基作为溶剂，在酶解过程中为细胞提供很好的营养供给，保证了细胞的活力。在本专利技术提供的一些实施例中，DMEM高糖基础培养基购买于Gibco公司。作为优选，完全培养基为Lonza完全培养基。 作为优选，Lonza完全培养基的配方为：无血清培养基+血清替代物+1X谷氨酰 胺、1XNEAA。在本专利技术提供的一些实施例中，Lonza完全培养基的配方为：无血清培养基、10%血清替代物、IX谷氨酰胺、IXNEAA。在本专利技术提供的一些实施例中，该试剂盒中还包括灌洗液，所述灌洗液为含有IX~3X青-链霉素和/或0.01%~0.04%EDTA的PBS。 作为优选，清洗采用灌洗液进行清洗，灌洗液为含有IX青-链霉素和0. 02%EDTA的PBS。在本专利技术提供的一些实施例中，在该试剂盒中还包括脐带保存液，脐带保存液为 含有IX~3X青-链霉素、50mg~100mg/mL乳糖醛酸、1%~5%羟乙基淀粉、5%脐血浆 的生理盐水。本专利技术提供了一种脐带静脉内皮细胞的原代分离培养方法及其试剂盒。该方法包 括：将酶解液灌注入脐带静脉，酶解，收集脐带静脉内皮细胞；用完全培养基培养脐带静脉 内皮细胞；酶解液的配方为含有II型胶原酶和透明质酸酶的基础培养基。本专利技术至少具有 如下优势之一：当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脐带静脉内皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将酶解液灌注入脐带静脉，酶解，收集脐带静脉内皮细胞；用完全培养基培养所述脐带静脉内皮细胞；所述酶解液的配方为含有II型胶原酶和透明质酸酶的基础培养基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陈海佳，王一飞，卢瑞珊，王小燕，李平，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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