一种无细胞百日咳疫苗的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，包括如下步骤：将pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分fha；将fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分pt；将fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分prn；将所述抗原组分fha、pt和prn配制成一种无细胞百日咳疫苗。本发明专利技术的方法实现单个目的抗原的高效表达，使百日咳杆菌基因工程菌株生长速度明显加快；降低了生产时间和生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种疫苗生产菌株研发领域，具体涉及。
技术介绍
百日咳是由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病。其临床特征为阵发性痉挛性咳嗽伴有深长的“鸡鸣”样吸气性吼声。百日咳杆菌，Bordetella pertussis，其主要侵犯的对象是孩童，有一半的个案是一岁以下的婴儿。百日咳杆菌的致病因子主要是百日咳毒素，pertussis toxin, PT,是由五个不同亚基sl-s5 (编码基因为ptxA, ptxB, ptxD, ptxE, ptxC组成的蛋白复合物,其毒性来自于si 亚基的ADP-核糖转移酶的活性。已采用的无细胞百日咳疫苗中，除PT外，还包含其他抗原分子如丝状血凝素，filamentous hemagglutinin, FHA,和百日咳粘着素，pertactin, Prn,而现有的无细胞百日咳疫苗生产工艺中，采用野生型百日咳杆菌菌株对抗原组分FHA，Pt，Prn进行发酵生产，FHA的纯化过程中Pt的含量高于规定的指标，往往使用一系列的化学试剂如甲醛对抗原FHA进行Pt脱毒处理。然而,这样的脱毒方法有如下的不利因素I.毒性逆转；2.在脱毒处理过程中的剧烈条件下降低FHA的免疫原性和得率；3.大量实验来评价每一批制剂中Pt毒性回复的程度，非常耗时；4.脱毒处理过程接触到有毒试剂，对于实验人员存在危险。此外，采用野生型百日咳杆菌菌株对抗原组分Prn进行发酵生产，其表达水平过低。因此，现有技术的针对无细胞百日咳疫苗中组分FHA，Pt，Prn采用野生型百日咳杆菌菌株进行发酵生产，无法做到使得每一个抗原的表达量在已掌握的技术能力下达到最优水平，会造成发酵工艺优化的瓶颈；此外，FHA，Pt和Prn同时在同一野生型百日咳杆菌菌株菌种中表达在纯化过程中会造成相互干扰，这些不利因素无疑增加了生产的人力，物力以及生产时间上的延长。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分别使用单独的百日咳杆菌基因工程改造菌株无细胞百日咳疫苗的生产方法。本专利技术的技术方案概述如下，其特征是包括如下步骤(I)将pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分fha ；(2)将fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分Pt ；(3)将fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分prn ；(4)将所述抗原组分fha、pt和prn配制成一种无细胞百日咳疫苗。所述pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株是通过下述方法获得的(I)通过同源重组用第一种抗生素抗性基因替换野生型百日咳杆菌基因组上的pertussis toxin编码基因(NCBI Reference Sequence :NC002929. 23987858-3992567)，所述 pertussis toxin 用 Pt 表不；(2)选择步骤(I)中得到的Pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株。所述fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株是用下述方法获得的(I)通过同源重组用第一种抗生素抗性基因替换野生型百日咳杆菌基因组上的fha 编码基因(NCBI Reference Sequence:NC002929. 21968781-1979553)；(2)选择步骤(I)中得到的敲除fha编码基因的百日咳杆菌菌株antIK A fha ；(3)将野生型百日咳杆菌基因组中的PT编码基因(NCBI Reference Sequence:NC 002929. 23987858-3992567)进行克隆并与第二种抗生素抗性基因连接成基因盒cassette pt-antll ；(4)通过同源重组用所述的基因盒cassette :pt_antll替换步骤(2)得到的百日咳杆菌菌株antIK A fha中基因组上的anti抗生素抗性基因；(5)选择步骤(4)中得到的fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株。所述fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株是用下述方法获得的(I)通过同源重组用第一种抗生素抗性基因替换野生型百日咳杆菌基因组上的fha编码基因；(2)选择步骤(I)中得到的敲除fha编码基因的百日咳杆菌菌株antIk A fha ；(3)将野生型百日咳杆菌基因组中的PRN的编码基因(NCBI Reference Sequence:NC_002929. 21098091-1100823)进行克隆并与第二种抗生素抗性基因连接成基因盒cassette prn-antll ；(4)通过同源重组用所述的基因盒cassette prn-antll替换步骤(2)得到的antIE A fha百日咳杆菌菌株中基因组上的anti抗生素抗性基因；(5)选择步骤(4)中得到的fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株。所述fha、pt 和 prn 的质量比为 2. 5-20:5-20:2-5。所述第一种抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、庆大霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。所述第一种抗生素抗性基因和第二种抗生素抗性基因不同，各自选自卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因。所述野生型百日咳杆菌为百日咳杆菌Tohoma I菌株(ATCC，BAA-589 )或Bordetella pertussis Cs百日咳杆菌Cs菌株(中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号CMCC58003。anti表示为第一种抗生素抗性基因；antll表示为第二种抗生素抗性基因；卡那霉素抗性基因(pCfffi 2. IVector, Invitrogen)、四环素抗性基因(GenBank:AY532632. ICloning vector pLAFR)、氯霉素抗性基因(GenBank:AY952933. !Cloning vector pHTSUB-106)。本专利技术的优点本专利技术的方法在百日咳杆菌内进行特定抗原基因的敲除或拷贝数的增加，或基因启动子的替换，从而构建出用于特定抗原生产的百日咳杆菌基因工程菌株，一方面使用单独的百日咳杆菌基因工程菌株，有利其单个目的抗原表达的发酵工艺优化，实现单个目的抗原的高效表达，在Prn和Pt百日咳杆菌基因工程菌株基因组DNA上的fha基因的敲除，Prn和Pt百日咳杆菌基因工程菌株生长速度明显加快，使得发酵周期从48 52h缩短为36 40h ;另一方面FHA百日咳杆菌工程菌株实现Pt基因敲除后，克服了现有技术存在的FHA生产过程中需要pt脱毒处理的工艺步骤，从而避免了 Pt脱毒工艺中的弊端，有利于保持抗原FHA的免疫原性和提高了 FHA的抗原得率，降低了生产时间和生产成本。本专利技术提供的prn的百日咳杆菌基因工程菌株，其prn基因在fha启动子的作用下，其表达水平提高了 5倍以上，提高了抗原组分Prn的得率，简化了生产工艺和降低了生产成本。附图说明 图I为不同百日咳菌株的生长曲线。图2为来自野生型百日咳菌株制备的Fha样品的SDS-PAGE图谱。图3为来自野生型百日咳菌株制备的Fha样品的层析图谱。图4为来自Pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株制备的Fha样品的SDS-PAGE 图谱。图5为来自pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株制备的Fha样品的层析图谱。图6来自fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，其特征是包括如下步骤：（1）将pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分fha；（2）将fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分pt；（3）将fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分prn；（4）将所述抗原组分fha、pt和prn配制成一种无细胞百日咳疫苗。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱涛，段磊，宇学锋，邵忠琦，毛慧华，邱东旭，
申请(专利权)人：天津康希诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：