非菌体性百日咳疫苗及其制备方法技术

含有纯化的毒素或其类毒素，丝状血凝素，ｐｅｒｔａｃｔｉｎ和菌毛凝集原的非菌体性百日咳疫苗制剂，可以为至少７０％的易感人群提供保护。菌毛凝集原可以从包特氏菌株，特别是百日咳杆菌菌株中制备，制备过程包括从细菌匀浆中抽提菌毛凝集原，并将抽提物浓缩和纯化。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及非菌体性百日咳疫苗，及其成分和制备方法。相关申请参考本申请是1995年7月12日提交的共同未决的美国专利申请第08/501,743号的部分继续申请，该申请是1995年5月4日提交的、共同未决的美国专利申请第08/433,646号的部分继续申请。
技术介绍
百日咳是由百日咳包特氏菌引起的严重传染性上呼吸道传染病。世界卫生组织估计每年约有6千万人罹患该病，50～100万人相关死亡(参考文献1。纵观该文，引用的诸多文献均列于括号中，它们详尽的叙述了本专利技术所属领域的现状。每篇引用文献的目录信息均附录于说明书之后、权利要求之前。这些公开内容在此引入，作为本公开内容的参考。)。未接种疫苗的5岁以下儿童的百日咳发病率高达80％(参考文献2)。尽管百日咳普遍被认为是一种儿童期疾病，但有越来越多的证据证明，在青少年和成人中，存在临床和无症状感染(参考文献3，4，5)。含有化学或热灭活的百日咳杆菌菌体的全菌体性疫苗在20世纪40年代的引入，使百日咳杆菌引起的百日咳的发病率得到显著降低。全菌体性百日咳疫苗的有效率根据对病例的不同定义估计可高达95％(参考文献6)。尽管百日咳杆菌感染后可获得终生免疫，但有越来越多的证据表明全菌体性百日咳疫苗免疫后，其保护作用逐渐减弱(参考文献3)。几篇报导叙述了全菌体性百日咳疫苗接种及其反应性和严重副作用的关系，致使疫苗的可接受性下降，随之而来的是百日咳重新流行(参考文献7)。最近发展了确定成分百日咳疫苗。确定成分百日咳疫苗抗原目前已发展了多种非菌体性百日咳疫苗，含有百日咳杆菌抗原，百日咳毒素(PT)，丝状血凝素(FHA)，69kDa外膜蛋白(百日咳杆菌黏附素(pertactin))和菌毛凝集原(见下表。附表在说明书末尾)。百日咳毒素百日咳毒素是一种外毒素，为具有ADP-核糖基转移酶活性的细菌毒素A/B家族中的一员(参考文献8)。这些毒素的A部分显示ADP-核糖基转移酶活性，B部分介导毒素与宿主细胞受体的结合，并将A转移至其作用部位。PT尚可促进百日咳杆菌对纤毛上皮细胞的粘附(参考文献9)，在百日咳杆菌侵袭巨噬细胞的过程中也具有一定意义(参考文献10)。所有非菌体性百日咳疫苗均含有PT，该物质被认为是主要的毒力因子和保护性抗原(参考文献11，12)。百日咳杆菌自然感染后，可产生针对PT的体液和细胞免疫(参考文献13～17)。婴儿具有通过胎盘获得的抗-PT抗体(参考文献16，18)，且人初乳中所含的抗-PT抗体可有效地被动保护小鼠抵抗通过空气的感染(参考文献19)。非菌体性疫苗免疫后，可产生针对PT亚基的细胞免疫(CMI)应答(参考文献20)，而接种全菌体性疫苗后，可产生针对PT的CMI应答(参考文献13)。在动物模型和人类中，全菌体性疫苗或成分疫苗中化学灭活的PT均具有保护性(参考文献21)。而且，针对S1亚基的单克隆抗体可对百日咳杆菌的感染提供保护(参考文献22，23)。PT的主要病理效应基于其ADP-核糖基转移酶活性。PT催化ADP-核糖从NAD转移到G1鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，从而干扰了细胞腺苷酸环化酶调节系统(参考文献24)。PT还阻止巨噬细胞和淋巴细胞向炎症部位的迁移，干扰中性粒细胞介导的吞噬作用和杀菌作用(参考文献25)。有很多体内和体外方法用来评价S1和/或PT的酶活性，包括牛转导蛋白的ADP-核糖基化法(参考文献26)，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞聚集法(参考文献27)，组胺致敏法(参考文献28)，白细胞增多法和NAD糖水解酶法。当CHO细胞与PT接触后，可显示一种特征性的聚集形态。这种现象有赖于PT的结合以及转位，S1的ADP-核糖基转移酶活性，因此，CHO细胞聚集法被广泛应用于检测PT全毒素的完整性和毒性。丝状血凝素丝状血凝素是一种非毒性的大(220kDa)多肽，在细菌定居过程中，介导百日咳杆菌对上呼吸道纤毛细胞的粘附(参考文献9，29)。自然感染可诱导抗-FHA抗体和细胞免疫(参考文献13，15，17，30和31)。人初乳中含抗-FHA抗体，并可通过胎盘传递(参考文献17，18和19)。接种全菌体性或非菌体性百日咳疫苗，可产生抗-FHA抗体，且含FHA的非菌体性疫苗还可诱导产生针对FHA的CMI应答(参考文献20，32)。在鼠呼吸道细菌攻击模型中，主动或被动免疫后，FHA是一种保护性抗原(参考文献33，34)。但是，在鼠脑内细菌攻击实验中，单独的FHA不具有保护鼠的潜能(参考文献28)。69kDa外膜蛋白(pertactin)69kDa蛋白是一种外膜蛋白，最初是从支气管败血性包特氏菌中鉴定的(参考文献35)。它是一种针对支气管败血性包特氏菌的保护性抗原，后来在百日咳杆菌和副百日咳杆菌中均得到鉴定。69kDa蛋白可与真核细胞直接连接(参考文献36)，百日咳杆菌自然感染后，可诱导抗-P.69的体液免疫应答(参考文献14)，P.69还可诱导细胞免疫应答(参考文献17，37，38)。接种全菌体性或非菌体性疫苗，可诱导产生抗-P.69抗体(参考文献32，39)，且非菌体性疫苗还可诱导产生针对P.69的CMI应答(参考文献39)。Pertactin在百日咳杆菌的气雾剂攻击实验中，可保护小鼠(参考文献40)，与FHA联合应用，在百日咳杆菌脑内攻击实验中，可保护小鼠(参考文献41)。被动转移的多克隆或单克隆抗-P.69抗体，可保护小鼠避免气雾剂攻击的感染(参考文献42)。凝集原百日咳杆菌的血清型是通过其菌毛凝集来确定的。WHO推荐的全菌体性疫苗包括1，2和3型凝集原(Aggs)，因为它们之间不具有交叉保护能力(参考文献43)。Agg1不是菌毛成分，存在于所有的百日咳菌株中，而血清型2和3Aggs则是菌毛成分。自然感染或接种全菌体性或非菌体性疫苗可诱导抗-Agg抗体(参考文献15，32)。小鼠气雾剂感染后，可产生针对Agg2和Agg3的特异性细胞免疫应答(参考文献17)。Aggs2和3在小鼠呼吸道细菌攻击实验中，具有保护作用，含有抗-凝集原抗体的人初乳在此试验中也具有保护作用(参考文献19，44，45)。非菌体性疫苗第一种非菌体性疫苗是由Sato等开发的双成分PT+FHA疫苗(JNIH6)(参考文献46)。这种疫苗的制备是从百日咳杆菌株Tohama的培养上清中纯化PT和FHA抗原，之后用福尔马林脱毒。1981年以来，日本成功地应用多厂家、多种组分的非菌体性百日咳疫苗免疫儿童，预防百日咳，使该病的发病率大大降低(参考文献47)。1986年，JNH6疫苗和一种单成分PT类毒素疫苗(JNH7)在瑞典进行了大型临床试验的测试。开始的结果显示，这两种疫苗的有效率较全菌体性疫苗报告的为低，但随后的研究显示，它们对通过血清学方法诊断的轻型疾病更有效(参考文献48，49，50，51)。但是，有证据显示这些疫苗中福尔马林灭活的PT出现毒性复活。还发现这些疫苗对疾病的保护性优于对感染的保护性。最近，评估了很多新的非菌体性百日咳疫苗，它们均含有PT，FHA，P.69和/或凝集原的组合物，这些疫苗列于表1。几种化学脱毒技术应用于PT，包括应用福尔马林(参考文献46)，戊二醛(参考文献52)，过氧化氢(参考文献53)和四硝基甲烷(参考文献54)灭活。但是，目前商用的非菌体性百日咳疫苗可能不含有适本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可以保护易感人群避免由百日咳杆菌感染引起疾病的疫苗组合物，包括选定相对剂量的可以为易感人群的至少约７０％成员提供保护的纯化型来自百日咳杆菌的百日咳类毒素，丝状血凝素，百日咳杆菌黏附素和凝集原制剂，该凝集原制剂基本不含凝集原１。

【技术特征摘要】
US 1995-5-4 08/433646;US 1995-7-12 08/5017431.一种可以保护易感人群避免由百日咳杆菌感染引起疾病的疫苗组合物，包括选定相对剂量的可以为易感人群的至少约70％成员提供保护的纯化型来自百日咳杆菌的百日咳类毒素，丝状血凝素，百日咳杆菌黏附素和凝集原制剂，该凝集原制剂基本不含凝集原1。2.权利要求1的疫苗，其中单人剂量含有约5～30μg氮的上述百日咳类毒素，约5～30μg氮的上述丝状血凝素，约3～15μg氮的上述百日咳杆菌黏附素，约1～10μg氮的上述凝集原制剂。3.权利要求1的疫苗，其可为至少约80％的阵发性咳嗽持续至少21天并有确切细菌感染证据的百日咳病例提供保护。4.权利要求1的疫苗，其可为至少约70％的咳嗽持续至少1天的轻型百日咳病例提供保护。5.权利要求1的疫苗，其可为约85％的阵发性咳嗽持续至少21天并有确切细菌感染证据的百日咳病例提供保护。6.权利要求1的疫苗，其中凝集原制剂包括菌毛凝集原2和菌毛凝集原3。7.权利要求6的疫苗，其中菌毛凝集原2与菌毛凝集原3的重量比约为1.5∶1～2∶1。8.权利要求1的疫苗，还包括破伤风类毒素和白喉类毒素。9.权利要求8的疫苗，其中的疫苗包括以下之任一(a)在单人剂量中，约10μg氮的百日咳类毒素制剂，约5μg氮的丝状血凝素制剂，约3μg氮的百日咳杆菌黏附素制剂，约5μg氮的菌毛凝集原制剂；或(b)在单人剂量中，约20μg氮的百日咳类毒素制剂，约20μg氮的丝状血凝素制剂，约3μg氮的百日咳杆菌黏附素制剂，约5μg氮的菌毛凝集原制剂。10.权利要求9的疫苗，其中白喉类毒素的量约为15Lfs，破伤风类毒素的量约为5Lfs。11.权利要求1的疫苗，还包括一种佐剂。12.权利要求12的疫苗，其中佐剂为磷酸铝或氢氧化铝。13.权利要求1-12之任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：JR沃瑟，REF法希姆，GE雅克森，LUL谈，A赫尔伯特，L鲍克斯，L巴雷托，J施哈王，MH克莱恩，
申请(专利权)人：康诺特实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]