分离百日咳杆菌保护性组分的方法技术

提供了有效分离百日咳杆菌保护性组分的方法，以对磷酸钙凝胶的吸附能力的差异为基础，从百日咳杆菌培养物中分离百日咳杆菌的保护性组分，所述磷酸钙凝胶是在存在过量磷酸离子的条件下，提供将钙离子加到百日咳杆菌培养物中而形成的。传统上，已经用用于不同组分的不同纯化方法，分离百日咳杆菌的保护性组分。根据本发明专利技术，使用同样的方法纯化所有的百日咳杆菌主要保护性组分。因此可以高效率和高回收率地纯化每个组分，对于工业生产是非常有利的一个方面。还可以有效地生产改进纯化的百日咳组分疫苗，该疫苗包括百日咳丝状血细胞凝集素（ＦＨＡ），ｐｅｒｔａｃｔｉｎ（ＰＲＮ，６９Ｋ－ＯＭＰ），百日咳菌毛（ＦＩＭ）和百日咳毒素（ＰＴ）的有效组分。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。通过适当混合由本专利技术方法分离的保护性组分，可以制备百日咳组分疫苗。疫苗被广泛地用于防止传染病。百日咳，一种因感染百日咳杆菌而引起的传染性呼吸疾病，由于窒息性(apneic)咳嗽同时偶尔伴有痉挛可能严重地影响患者，特别是婴儿。为了治疗这种疾病，实践中均是使用灭活后的百日咳杆菌全培养细胞(灭活的疫苗)。但是，已经报告了在接种位点的定位反应和副反应，如发烧，从而社会上急需解决此问题。为了解决该问题， 已经进行了许多使用从百日咳杆菌中分离的保护性组分作为疫苗的尝试。例如，通过从百日咳杆菌中提取保护性蛋白质，如百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)，除去内毒素(ET)而制备无细胞百日咳疫苗(ACP疫苗)，但由于下述缺陷而并不完全令人满意。用相应的方法分离了百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)，(所有均是已经在实践应用中有效的百日咳杆菌保护性组分)。用人结合珠蛋白作为配体的亲和层析可分离百日咳毒素(PT)。但是由于人结合珠蛋白是从人血中收集的，因此可能受到肝炎病毒的污染；使用动物血清时有相同的问题。另一种方法是使用变性的血浆铜蓝蛋白作为配体的亲和层析(日本未审查专利No.62135/1987)。尽管该方法没有病毒污染的问题，但产生了其他一些问题，包括血浆铜蓝蛋白和硫氰酸钠的高毒性和强身体滞留以及有蛋白质变性作用的其他洗脱剂的污染疫苗。就百日咳丝状血细胞凝集素(PHA)来说，可利用的是使用羟基磷灰石的纯化方法。但是该方法要花长时间进行柱操作而且由于羟基磷灰石的高成本而不经济。就pertactin(PRN，69K-OMP)来说，使用小鼠血清作为配体进行亲和层析，但也有上述缺陷。就百日咳菌丝(FIM)来说，通过用硫酸铵和氯化镁盐析来纯化百日咳杆菌细胞提取物，但由于产率低该方法在疫苗生成效率方面是很差的。有一种通过用氢氧化铝凝胶吸附而制备革兰氏阴性菌疫苗的方法(WO93/10216)。该方法需要大量的氢氧化铝凝胶，来吸附在革兰氏阴性菌中产生的保护性组分和内毒素。用WO93/10216的方法得到的疫苗由于稀释的疫苗而将内毒素释放体内，因而有副作用，如发烧和内毒素-休克的危险。就包括组分混合物而不必分离百日咳杆菌中的每个组分的百日咳疫苗生产而言，一种可以得到的方法是使用磷酸钙凝胶(EP-A-291968，日本未审查专利No.52726/1989)。但是在该方法中，存在1M氯化钠的时，形成的磷酸钙并不吸附保护性组分。如上所述，总的来讲，必须使用不同的纯化方法分离百日咳杆菌中的相应的保护性组分。由于辛苦的操作和实践应用难，所以该方法不适用于疫苗的大规模生产。此外，在现有技术中公开的分离保护性组分的常规方法还存在材料或试剂有致病性或毒性的问题。针对上述背景，本专利技术人研究了有效分离百日咳杆菌的保护性组分的方法，发现在存在过量磷酸离子的条件下，向百日咳杆菌培养物中加入钙离子，可以有效地从百日咳杆菌中分离百日咳杆菌的保护性组分。在这一发现的基础上，本专利技术人作了进一步的研究，将有效安全分离保护性组分的方法与磷酸钙凝胶处理和盐洗脱以及加热结合在一起，构成了本专利技术。因此，本专利技术涉及(1)通过将百日咳杆菌培养物与磷酸钙凝胶接触而分离百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一种的方法，所述磷酸钙凝胶是通过在存在磷酸离子的条件下，将钙离子加到培养物中而形成的。(2)通过将百日咳杆菌培养物分离到细胞和培养液中并完成(A)，(B)，(C)和(D)步骤中的至少一个步骤而分离百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一个成员的方法(A)在此步骤中，用盐溶液洗脱分离的细胞，使洗脱的溶液与上述(1)中的磷酸钙凝胶接触而分离百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，(B)在此步骤中，在存在盐溶液的条件下，将从上述步骤(A)中洗脱处理的细胞残留物加热，然后与磷酸钙凝胶接触，通过将洗脱的溶液与上述(1)中的磷酸钙凝胶接触而分离pertactin(PRN，69K-OMP)，(C)在此步骤中，在存在盐溶液的条件下，将从上述步骤(A)中洗脱处理的细胞残留物加热，将上清液与磷酸钙凝胶接触并用盐溶液洗脱，通过将洗脱的溶液与上述(1)中的磷酸钙凝胶接触而分离百日咳菌毛(FIM)，(D)在此步骤中，将培养物或分离培养液与上述(1)中的磷酸钙凝胶接触，从所述上清液中分离百日咳毒素(PT)。(3)上述(2)中的分离方法，其中将所述上清液与磷酸钙凝胶接触，然后用盐溶液洗脱以分离在步骤(A)中的百日咳丝状血细胞凝集素。(4)上述(2)中的分离方法，其中将所述上清液与磷酸钙凝胶接触后，与离子交换凝胶接触，以分离步骤(B)中的pertactin(PRN，69K-OMP)。(5)上述(2)中的分离方法，其中将所述上清液与磷酸钙凝胶接触，然后除去，将所得的残留物用盐溶液洗脱以分离步骤(C)中的百日咳菌毛(FIM)。(6)上述(2)中的分离方法，其中将所述上清液与离子交换凝胶接触以分离步骤(D)中的百日咳毒素(PT)。(7)上述(2)中的分离方法，其中在步骤(A)和(C)中所用的盐溶液是含碱金属盐的缓冲液。(8)上述(7)中的分离方法，其中所述盐溶液是含0.01-1.0M氯化钠的缓冲液。(9)上述(1)或(2)中的分离方法，其中，在存在磷酸离子的条件下，将钙离子加到pH7-9的培养物或上清液中而形成磷酸钙凝胶。(10)上述(9)中的分离方法，其中磷酸离子和钙离子的当量比为每当量钙离子1.25-30当量的磷酸离子。(11)上述(9)中的方法论方法，其中存在0.05-0.1M磷酸盐缓冲液时，加入0.1-2w/v％的醋酸钙作为钙离子源而形成磷酸钙凝胶。(12)上述(1)或(2)中的分离方法，其中分离百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)中的至少一个成员，此后，在存在硫酸铵的条件下，吸附到氢氧化铝凝胶上而除去内毒素。(13)上述(1)或(2)中的分离方法，其中分离百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)中的至少一个成员，此后通过区离心除去内毒素。(14)百日咳疫苗，其中PT∶FHA∶FIM的混合比例为4-6∶8-10∶1。(15)百日咳疫苗，其中PT∶FHA∶∶PRN∶FIM的混合比例为2-6∶4-10∶1-1∶1。用于本专利技术的百日咳杆菌菌株不受限制，只要它能够产生百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)，所有百日咳杆菌保护性组分中的一个或一个以上的成员就行。有用的菌株包括已知菌株如百日咳杆菌TohamaPhase I菌株(保存在thenational institute of Health，Ministr本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过将百日咳杆菌培养物与磷酸钙凝胶接触而分离百日咳丝状血细胞凝集素（ＦＨＡ），ｐｅｒｔａｃｔｉｎ（ＰＲＮ，６９－ＯＭＰ），百日咳菌毛（ＦＩＭ）和百日咳毒素（ＰＴ）中的至少一个成员的方法，所述磷酸钙凝胶是通过在存在磷酸离子的条件下，将钙离子加到培养物而形成的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：末原章宏，山本英治，藤井重男，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]