具有减弱的蛋白酶活性的嗜血杆菌Hin47类似物制造技术

一种具有减弱的蛋白酶活性的分离和纯化的嗜血杆菌Ｈｉｎ４７蛋白的类似物，所述类似物的蛋白酶活性大约低于天然Ｈｉｎ４７蛋白的１０％，且优选具有与天然Ｈｉｎ４７蛋白基本相同的免疫原性。一段分离和纯化的编码Ｈｉｎ４７类似物的核酸分子可以提供于一个重组质粒，所述质粒可以被导入生长以产生Ｈｉｎ４７类似物的细胞。将包括Ｈｉｎ４７类似物和编码核酸的免疫组合物配制成疫苗体内施用给宿主，包括人，以赋予所述宿主抗由产生Ｈｉｎ４７蛋白或能够在宿主中诱导与Ｈｉｎ４７蛋白特异性反应的抗体的蛋白质的致病菌，包括嗜血杆菌种，例如流感嗜血杆菌引起疾病的保护作用，所述Ｈｉｎ４７蛋白及所述编码核酸也可以用于诊断应用。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学领域并且特别与来自嗜血杆菌属的种的免疫原和抗原有关。相关的申请本申请是于1994年8月24日申请的美国专利申请号No.08/296,146的部分继续，而后者又是1994年7月21日申请的序列号为No.08/278,091的专利申请的部分继续。本专利技术的背景流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)是引起许多严重的人类疾病例如脑膜炎，会厌炎，肺炎和中耳炎的生物，流感嗜血杆菌b型(Hib)是五岁以下儿童细菌性脑膜炎的主要致病菌。对这种疾病的预防抗体是通过该生物的荚膜多糖诱导得到而且已经利用纯化的多聚核糖基核糖磷酸PDR作为抗原研究疫苗。这种疫苗对于成人以及24月以后的小孩有90％以上的预防作用，但对于24月以前的小孩则无效(Zangwill等1993)。(参考文献在公开内容后的参考文献表中列出，因此在表中引入的参考文献不再指明出处)。类似于其它多糖抗原，PRP并不诱导T-助细胞的增殖，再免疫也不引出加强免疫应答或者记忆细胞的增加，这种疫苗可以通过PRP多糖与蛋白质载体的偶合获得T-细胞依赖性并且极大地增强对PRP抗原的免疫反应。目前，有四种PRP-载体偶合的疫苗。这些疫苗都是基于流感嗜血杆菌b型的荚膜多糖与白喉类毒素，破伤风类毒素，或Neisseriameningitidis外膜蛋白的偶合。这些流感嗜血杆菌b型偶合疫苗已经大大地降低了细菌性脑炎的发生率(Schoendorf等，1994)。流感嗜血杆菌有六种血清型，命名为a到f，这是根据它们的荚膜多糖来定义的。目前的嗜血杆菌偶合疫苗不能对其它侵染型菌株起预防作用(血清型a和c)，重要的是，也不能对导致产后和新生儿脓毒症，肺炎和中耳炎的主要致病菌-不可分型的菌株(NTHi)产生预防作用。中耳炎是早期儿童的最普遍疾病，大约有70％的儿童在七岁以前至少感染一次。慢性中耳炎能够导致小孩听、说和识别能力的损伤，它主要是由肺炎链球菌(Streptococeus Pneumoniae)(占约50％)，不可分型的流感嗜血杆菌(H.influcncae)(约30％)以及Moraxella(Branhamella)catasrhalis(约20％)引起的。仅在美国一个国家，每年为治疗中耳炎所花费的抗体以及手术例如扁桃体切除术，腺状体切除术以及插入鼓膜骨状导管的费用已在1-2亿美元之间。为了达到对流感嗜血杆菌相关疾病的广泛预防效果，尤其是对2到6个月龄人群及其它高危人群的广泛预防效果，提供保守的，能交叉反应的无荚膜的流感嗜血杆菌免疫原是人们所希望的。对于那些对呼吸道感染尤其敏感的年长人群或其它患者来说，不可分型的菌株是肺炎的重要病因，因而需要来自流感嗜血杆菌的抗原，它可用作提供针对许多流感嗜血杆菌的血型的保护的致免疫制剂的成分。PCT申请WO 92/10936(1992年7月9日公开，在这里引入作为参考)描述了从流感嗜血杆菌中得到的，报告为粘附素的47,000道尔顿的外膜蛋白并命名为Hin47，它在不可分型的、b型和未确定型的流感嗜血杆菌临床分离株中免疫保守。在1992年5月26日-30日于新奥尔良召开的美国微生物学会会议上，Hin47的氨基酸顺序以及编码Hin47的基因的核苷酸顺序已经公开。这些序列也发表在1994年1月6日出版的PCT申请WO 94/00149中(在此引入作为参考)。由于Hin47在流感嗜血杆菌菌株间相对保守，并被报道为一种粘附素，这种蛋白用于由产生Hin47、或者能够产生与Hin47特异性反应的抗体的蛋白的流感嗜血杆菌或其他病原菌引起疾病的诊断和疫苗。但是，作为诊断中的抗原、产生诊断中有用的抗-Hin47抗体以及在疫苗中作为一种免疫原来说，Hin47的缺点是本专利技术人发现Hin47具有导致Hin47的自我降解和对此中混合的其它抗原的蛋白降解反应的蛋白酶活性。提供基本上具有减弱蛋白水解活性的Hin47蛋白的类似物(本文有时指突变或衍生物)以作为抗原，致免疫制剂包括疫苗，其它免疫原载体以及诊断性产物的产生等是有优利的。本专利技术综述本专利技术涉及提供具有减弱的蛋白酶活性的嗜血杆菌Hin47蛋白类似物。本专利技术的一个方面是提供一个具有减弱的蛋白酶活性的分离和纯化的流感嗜血杆菌Hin47蛋白类似物。所述类似物的蛋白酶活性大约低于天然Hin47蛋白的10％。所述Hin47蛋白类似物优选地具有与天然Hin47蛋白基本相同的免疫原性。本专利技术的类似物可以从天然Hin47蛋白通过化学的，生化的或遗传的修饰来获得。在本专利技术的一个实施方案中，当通过遗传修饰来获得类似物时，至少一个在天然Hin47蛋白中引起蛋白酶活性的氨基酸被缺失或为一个不同的氨基酸替代以产生减弱的蛋白酶活性。或者，减弱的蛋白酶活性也可以通过在天然Hin47蛋白中插入至少一个氨基酸而获得。至少一个被缺失或替代的所述氨基酸可以选自Hin47蛋白的195到201氨基酸，而且具体地可以是197位置的丝氨酸被缺失或为丙氨酸、苏氨酸或半胱氨酸所替代。另外至少一个所述缺失或替代的氨基酸也可以是91的组氨酸而且可以被缺失或为丙氨酸、赖氨酸或精氨酸所替代，更进一步，至少一个被缺失或替代的氨基酸可以是121的天冬氨酸，而且可以被缺失或为丙氨酸所替代。另外，可以缺失或替代Hin47蛋白分子中的多个氨基酸，这些多个氨基酸可包括91位组氨酸和197位丝氨酸，而且它们被缺失或为91位丙氨酸和197位丙氨酸所替代以产生Hin47蛋白类似物H91A/S197A。另外，所述多个氨基酸也可包括91位组氨酸，121位天冬氨酸和197位丝氨酸，而且它们被缺失或为91位丙氨酸，121位丙氨酸和197位丙氨酸所替代以产生Hin47类似物H91A/D121A/S197A。一些Hin47蛋白类似物的某些特性小结可见表3。只有一个Hin47突变体D121E被发现保留基本的蛋白酶活性。在另一方面，本专利技术提供含有编码流感嗜血杆菌Hin47蛋白类似物的突变体流感嗜血杆菌Hin47基因的分离并纯化的核酸分子，所述突变Hin47基因可以编码上面讨论过的任一Hin47类似物。突变基因优选地通过对一种野生型Hin47基因定点诱变而得到。该核酸分子可包含于适于转化宿主的重组质粒，也可以是质粒DS-1011-1-1(于1994年7月27日存于ATCC美国典型培养物收集中心，罗克维尔，马里兰，美国，批准号No.75845)，本专利技术还包括含有这样一个重组质粒的转化细胞。在另一方面，本专利技术也包括产生具有减弱的蛋白酶活性的流感嗜血杆菌Hin47类似物的方法，所述类似物的蛋白酶活性低于天然Hin47蛋白的10％。包括确定至少一个Hin47蛋白中的引起蛋白酶活性的氨基酸残基，对Hin47基因进行定点诱变以缺失或替代一个编码该氨基酸的核苷酸，将突变的Hin47基因导入一个细胞以得到一个转化细胞并能对该转化细胞进行培养以生产Hin47类似物。所选择的至少一个氨基酸可以是以上就Hin47类似物具体地确定的任何一个。突变的Hin47基因的导入优选地产生转化细胞，该转化细胞中突变Hin47基因处于T7启动子的控制之下，而且优选地通过在诱导浓度的乳糖中培养而使转化细胞生长，并通过T7启动子表达Hin47类似物。该突变的Hin47基因最好通过用重组质粒DS-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有减弱的蛋白酶活性的分离和纯化的流感嗜血杆菌Ｈｉｎ４７蛋白的类似物，所述类似物的蛋白酶活性大约低于天然Ｈｉｎ４７蛋白的１０％。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：SM卢斯莫，YP杨，P庄，RP奥门，MH克莱恩，
申请(专利权)人：康诺特实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]