本发明专利技术涉及疫苗学领域，具体的说是一种鳗弧菌减毒疫苗及其应用。减毒疫苗菌株为鳗弧菌C312在含逐渐升高浓度的利福平的培养基中培养，直至培养到培养基中利福平浓度为100ug/ml，所得转化菌株为减毒疫苗菌株C312RM。本发明专利技术的疫苗可经由口服或浸泡方式传递，因此避免了常规的注射传递模式，操作简单，成本低廉，可以广泛用于各种养殖条件，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗学领域，具体的说是一种鳗弧菌减毒疫苗及其应用。
技术介绍
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种革兰氏阴性细菌,能感染包括奸类、贝类和鱼类等水产养殖动物，诱发危害严重的弧菌病。在鱼类中，已发现鳗弧菌可感染多种海水和淡水鱼，包括虹鳟、牙鲆、大菱鲆、鳗鲡、大黄鱼等。鳗弧菌是一种条件致病菌，其诱发的弧菌病容易发生在不良的养殖环境条件下，如高温、高养殖密度等。在欧美，弧菌病防控多年来依靠灭活性多联疫苗。在我国，目前还没有商业化鳗弧菌疫苗。已报导的实验室鳗弧菌疫苗主要包括灭活疫苗和亚单位疫苗，尚无减毒疫苗。减毒疫苗是通过对病原菌株人为突变，随后筛选毒力降低的突变株而获得。减毒疫苗的优点是能够通过细菌自身残留的毒力入侵宿主，从而模拟自然感染，诱发强大的宿主免疫反应。基于这一特点，许多减毒疫苗可通过浸泡和口服的方式传递，从而避免了昂贵的注射途径，因此在应用上有很好的市场价值。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种鳗弧菌减毒疫苗及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种鳗弧菌减毒疫苗，减毒疫苗菌株为鳗弧菌C312在含逐渐升高浓度的利福平的培养基中培养，直至培养到培养基中利福平浓度为100ug/ml，所得转化菌株为减毒疫苗菌株 C312RM。将鳗弧菌C312在含有I. 5ug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天，挑取转化子，将转化子在含有3ug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天选取转化子，将转化子在含有6ug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天选取转化子；如此重复，直至LB培养基中利福平浓度达100ug/ml，由此获得的转化子即为减毒疫苗菌株C312RM。所述减毒疫苗菌株C312RM与海藻酸钠微球按体积比I :1. 67混合，作为海豚链球菌免疫口服药物；或将减毒疫苗菌株C312RM于LB培养基中培养至OD6tltl=O. 8-1离心沉淀于海水中重悬作为海豚链球菌免疫浸泡药物。本专利技术具有如下优点本专利技术的疫苗可经由口服或浸泡方式传递，因此避免了常规的注射传递模式，操作简单，成本低廉，可以广泛用于各种养殖条件，具有良好的应用前旦-5^ O具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法实施例I鳗弧菌减毒疫苗的构建方法将鳗弧菌C312在含有I. 5ug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天，挑取一个转化子，将转化子在含有3ug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天，挑取一个转化子，再将转化子在含有6ug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天，挑取一个转化子。如此逐渐升高利福平浓度，直至利福平浓度达100ug/ml，(在含逐渐升高浓度的利福平的培养基中培养梯度为，I. 5ug/ml、3ug/ml、6ug/ml、12ug/ml、24ug/ml、48ug/ml 和 100ug/ml),在此培养基中挑取一个转化子，命名为C312RM。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨·，O. 5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5%蒸馏水。所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 6250，保藏日期2012. 6. 21，分类命名为鳗弧菌(Vibrioanguillarum)。实施例2C312RM毒力检测用半致死量(LD5tl)测定方法(具体方法参见文献WangH，Hu Y，Zhang Wj Sun L. Construction of an attenuated Pseudomonas fluorescensstrain and evaluation of its potential as a cross-protective vaccine.Vaccine2009;27:4047 — 55)检测C312RM与野生株C312的毒力，发现野生株C312的LD50为IO6CFU,而减毒转化子C312RM的LD5tl为I. 5xl08CFU。因此，较之于野生株C312，减毒转化子C312RM的毒力大幅下降，是一株减毒株。实施例3鳗弧菌减毒疫苗C312RM的应用步骤I)疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料的制备。在LB培养基中于28°C培养C312RM至OD6tltl为0. 8 — 1，然后离心(5000g，4°C ) lOmin。收集菌体，将其悬浮于普通海水中至终浓度为lxl09cfu/ml，即为C312RM悬浮液。将50ml海藻酸钠(质量百分比3%)与30ml C312RM悬浮液或PBS (对照)混合，随后加入2000ml石蜡、10ml S-80乳化剂(皆购于美国Sigma公司)以及50ml氯化钙(0. 15M)(购于上海Sangon公司)；将含有15947和PBS对照的混合液分别离心(1000g，IOmin),收集沉淀；将含有15947和PBS的沉淀分别与IOOOg鱼饲料(购于山东升索渔用饲料研究中心)混合，用F(II)-26双螺杆挤条制粒机(华南理工大学，广州)加工制成颗粒饲料(I. 5mmX 2. 0mm)，即为疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料。所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl, 0. 02 % KCl, 0. 358 %Na2HPO4. 12H20, 0. 024% NaH2PO4。步骤2)疫苗浸泡液的制备。在LB培养基中于28°C培养C312RM至OD6tltl为0. 8 —I,然后离心(5000g，4°C)10min。收集菌体，将其悬浮于海水中至终浓度为2xl07cfu/ml，即为疫苗浸泡液。步骤3)C312RM作为口服疫苗的应用。将60条牙鲆(每条重约12. 6g)随机分为2(每组30条)，分别命名为A和B。将A (样品组)和B (对照组)组鱼分别喂食上述步骤I)的疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料，持续3天。步骤4)C312RM作为浸泡疫苗的应用。将60条牙鲆(每条重约12. 6g)随机分为2(每组30条)，分别命名为C和D。将C (样品组)和D (对照组)组鱼分别在上述步骤2)的疫苗浸泡液和普通海水中浸泡6小时。步骤5)疫苗的免疫保护效应检 测。在LB培养基中培养鳗弧菌C312至0D_为O.8，然后离心(5000g，4°C，10min)。收集菌体，将C312悬浮于海水中至终浓度为IxlO8Cfu/ml,即为鳗弧菌悬液。在上述步骤3)和4)免疫后的第30天，将4组鱼在鳗弧菌悬液中浸泡4h，随后将4组鱼置入正常海水中养殖。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，8条；B组，20条；C组，6条；D组，18条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS=IOOxd 一免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)据此算出C312RM作为口服疫苗的免疫保护效率为60%，C312RM作为浸泡疫苗的免疫保护效率为67%。故本专利技术的鳗弧菌减毒菌C312RM可作为口服和浸泡疫苗而有效地保护牙鲆抵御鳗弧菌感染。权利要求1.一种鳗弧菌减毒疫苗，其特征在于减毒疫苗菌株为鳗弧菌C312本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鳗弧菌减毒疫苗,其特征在于：减毒疫苗菌株为鳗弧菌C312在含逐渐升高浓度的利福平的培养基中培养，直至培养到培养基中利福平浓度为100ug/ml，所得转化菌株为减毒疫苗菌株C312RM。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，于兰萍，胡永华，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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