本发明专利技术涉及猪乙脑疫苗及其制备方法。其中，制备猪乙脑疫苗的方法包括：利用生物反应器将BHK-21细胞进行悬浮培养，以便获得BHK-21细胞悬浮液；将SA14-14-2株乙脑病毒接种于BHK-21细胞悬浮液中进行培养，以便获得富集乙脑病毒的培养液；以及将富集乙脑病毒的培养液依次进行冻融和离心，以便收集富集的乙脑病毒，获得猪乙脑疫苗。利用该方法，能够以工业化规模、高效地生产猪乙脑疫苗，并且获得的猪乙脑疫苗质量优良，病毒含量高，能够有效地用于猪乙脑预防接种，且免疫效力高、免疫效果稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药领域，具体地，本专利技术涉及。
技术介绍
乙型脑炎简称乙脑，是由乙型脑炎病毒引起的一种人畜共患传染病。本病最早发现于日本，所以又称日本乙型脑炎。乙脑是人畜共患的自然疫源性疾病，人与许多动物都可以成为本病的传染源，乙脑是严重威胁人类和动物健康的传染性疾病，对畜牧业造成严重的危害。在动物中，猪是主要的乙脑病毒的主要宿主，乙脑病毒必须依靠吸血雌蚊作媒介进行传播，流行环节是猪-蚊-猪。自然环境中，猪的感染率很高，仔猪经过一个流行季以后几乎100%感染。猪感染乙脑后多出现高热，精神沉郁或有神经症状，食欲减退，有的出现麻痹症状。 由于乙型脑炎是由蚊子叮咬而引起的，我们无法完全消灭蚊子也无法阻止猪只不被蚊子咬，因此，注射疫苗成为预防乙型脑炎的首选。然而，目前的乙脑疫苗制备方法效率低，制备的乙脑疫苗病毒含量低、免疫效力低、免疫效果不稳定。因此，目前制备乙脑疫苗的方法仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的现阶段，我国使用猪乙型脑炎活疫苗(SA14-14-2株)进行猪预防接种，注射后3周可产生坚强的免疫力，能有效预防猪乙脑的发生。目前商业化的猪乙型脑炎活疫苗采用原代地鼠肾细胞转瓶工艺进行生产，由于原代细胞制备过程复杂，并且使用转瓶培养细胞，整个生产过程完全采用人工手工操作，容易造成制品的污染以及产品质量的不稳定，不适合乙脑疫苗工业化大规模生产。本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的申请人经过艰苦的努力寻找并发现了可解决上述技术问题的关键因素一BHK-21细胞。BHK-21细胞是一种可连续传代培养的地鼠肾细胞，已经成功用于猪口蹄疫疫苗、犬狂犬病疫苗的生产，是一种良好的疫苗生产用细胞。与原代地鼠肾细胞比较，使用BHK-21细胞制备疫苗，由于BHK-21细胞可连续传代培养，经多代扩增培养后可得到大量细胞用于制备疫苗，因此克服了细胞来源限制问题。同时由于BHK-21细胞可采用生物反应器悬浮培养，在严格可控的培养条件下，细胞能在最适合的条件下生长繁殖，细胞生长迅速且状态良好，培养获得的细胞密度远远高于转瓶培养，更适合工业化生产。此外，本专利技术的专利技术人还发现，BHK-21细胞对乙脑病毒敏感，接种乙脑病毒后3-4天出现细胞病变，适于乙脑病毒的培养。由此，本专利技术提出了一种乙脑疫苗及其制备方法。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种制备猪乙脑疫苗的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤利用生物反应器将BHK-21细胞进行悬浮培养，以便获得BHK-21细胞悬浮液；将SA14-14-2株乙脑病毒接种于BHK-21细胞悬浮液中进行培养，以便获得富集乙脑病毒的培养液；以及将富集乙脑病毒的培养液依次进行冻融和离心，以便收集富集的乙脑病毒，获得猪乙脑疫苗。专利技术人惊奇地发现，利用该方法，能够以工业化规模、高效地生产猪乙脑疫苗，并且获得的猪乙脑疫苗质量优良，病毒含量比现有商业化转瓶制备的疫苗高10倍，能够有效地用于猪乙脑预防接种，且免疫效力高、免疫效果稳定。此外，根据本专利技术的实施例，该方法还具有设备体积小、节省空间，放大容易，工艺可控性好，对操作人员要求不高等优点。根据本专利技术的实施例，在本专利技术的制备猪乙脑疫苗的方法中，利用生物反应器将BHK-21细胞进行悬浮培养的方法不受特别限制，只要能够将BHK-21种子细胞进行连续传代扩增培养，获得大量可用于疫苗制备的细胞即可。根据本专利技术的一些实施例，利用生物反应器将BHK-21细胞进行悬浮培养可以进一步包括于摇瓶中，利用含10体积％新生牛血清的MD611培养基将BHK-21种子细胞依次进行第一悬浮培养和转种培养，以便获得第一 BHK-21细胞悬浮液，其中经过第一悬浮培养的BHK-21种子细胞的细胞密度不小于 2X IO6细胞/ml，优选不小于2. 3 X IO6细胞/ml，第一 BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于2. 5 X IO6细胞/ml ;将第一 BHK-21细胞悬浮液接种于第一生物反应器中，并添加含2体积％新生牛血清的MD611培养基，进行第二悬浮培养，以便获得第二BHK-21细胞悬浮液，该第二BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于2X IO6细胞/ml，优选不小于3. 4X IO6细胞/ml ;将第二 BHK-21细胞悬浮液接种于第二生物反应器中，并添加含2体积％新生牛血清的MD611培养基，进行第三悬浮培养，以便获得前述的BHK-21细胞悬浮液，该BHK-21细胞悬浮液中细胞密度不小于I. 5X IO6细胞/ml，其中，第二生物反应器的容量大于第一生物反应器，第一生物反应器的容量大于摇瓶。由此，能够有效地将BHK-21种子细胞进行连续传代扩增培养，从而能够获得大量可用于疫苗制备的细胞。此外,根据本专利技术的实施例，前述的第一悬浮培养、转种培养、第二悬浮培养以及第三悬浮培养的培养条件以及所采用的设备均不受特别限制，只要适于将BHK-21种子细胞进行连续传代扩增培养即可。根据本专利技术的一些优选实施例，摇瓶的容量为250ml，第一生物反应器的容量为10L，第二生物反应器的容量为100L，由此，能够逐步、有效地将BHK-21种子细胞进行连续传代扩增培养，从而能够获得大量可用于疫苗制备的细胞。根据本专利技术的具体示例，第一悬浮培养是在37°C温度，120rpm转速下培养3_4天，由此，能够有效地使经过第一悬浮培养的BHK-21种子细胞的细胞密度不小于2. 3X IO6细胞/ml，以便进行后续的转种培养，进而能够进行后续的传代扩增培养。根据本专利技术的一些实施例，转种培养是按I :4的体积比例进行细胞转种，在37°C温度，120rpm转速下培养3-4天，由此，能够有效地使第一 BHK-21细胞悬浮液中的细胞密度不小于2. 5 X IO6细胞/ml，进而能够进行后续的传代扩增培养，以便实现细胞的扩增。根据本专利技术的另一些实施例，第二悬浮培养是在36-37°C温度，80-100rpm转速，pH 7. 1-7. 2，溶氧浓度40-60%下培养4-5天，优选在36. 5°C温度，90rpm转速，pH 7. 15，溶氧浓度50%下培养4天，由此，能够有效地使第二 BHK-21细胞悬浮液中的细胞密度不小于3. 4X IO6细胞/ml，进而能够进行后续的第三悬浮培养，从而实现细胞的传代扩增。根据本专利技术的一些具体示例，第三悬浮培养是在36-37°C温度，80-100rpm转速，pH 7. 1-7. 2，溶氧浓度40-60%下培养2-3天，优选在36. 5°C温度，90rpm转速，pH 7. 15，溶氧浓度50%下培养3天，由此，能够有效地获得细胞密度不小于I. 5 X IO6细胞/ml放入BHK-21细胞悬浮液，从而能够成功地通过连续传代扩增获得大量可用于疫苗制备的细胞。根据本专利技术的实施例，在本专利技术的制备猪乙脑疫苗的方法中，SA14-14-2株乙脑病毒的病毒滴度不小于108_°TCID5(l/ml。由此，能够使SA14-14-2株乙脑病毒有效地感染BHK-21细胞，并能够通过培养高效地生产富集乙脑病毒，从而能够有效地获得富集乙脑病毒的培养液。其中，需要说明的是，本文中所使用的术语“病毒滴度”是指病毒的含量，衡量病毒滴度的单位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MI本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备猪乙脑疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用生物反应器将BHK？21细胞进行悬浮培养，以便获得BHK？21细胞悬浮液；将SA14？14？2株乙脑病毒接种于所述BHK？21细胞悬浮液中进行培养，以便获得富集乙脑病毒的培养液；以及将所述富集乙脑病毒的培养液依次进行冻融和离心，以便收集富集的乙脑病毒，获得所述猪乙脑疫苗。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：熊炜，高杨，刘俊生，刘延亭，
申请(专利权)人：北京中联康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。