血管内皮细胞表面决定簇部分多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鸡CD34部分多肽，其中，其氨基酸序列为：Cys?Gln?Ser?Ser?Ala?HisPro?Ser?Thr?His?Pro?Ser?Val?His?Pro?Ser?Thr?His，本发明专利技术提供了一种血管内皮细胞表面决定簇部分多肽，该多肽的特异性和敏感性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种血管内皮细胞表面决定簇部分多肽，本专利技术特别涉及鸡的血管内 皮细胞表面决定簇部分多肽及多肽的应用。
技术介绍
多克隆抗体技术(Polyclone antibodies preparation technique)，抗原朿Ij激机 体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋 白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗原通常是 由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所 产生的抗体称之为单克隆抗体(Monclone antibody) 0由多种抗原决定簇刺激机体，相应 地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所 产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺 激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽 类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来 决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊 断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗 体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用 的抗体，多用兔和羊制备。免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊 娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差 异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。血管内皮细胞表面决定簇CD;34(Cluster of Differentiation 34，白细胞分化 抗原34)是一种分子量为105kD-120kD的高度糖基化的I型跨膜蛋白，其分子中的35% 氨基酸由苏氨酸和丝氨酸组成。这种蛋白能够选择性地表达于早期造血干细胞、胚胎纤 维母细胞和内皮祖细胞的膜表面。在二十世纪八十年代中期，Civin等人首次用髓系细 胞KG-Ia制备出单克隆抗体MylO，发现这种抗体能够特异性地与造血干细胞的膜蛋白相 结合，并将此膜蛋白命名为CD34抗原。进而发现，编码CD34抗原基因位于第一条染色 体长臂上，全长cDNA为2.651Λ，ORF为119bp，编码383个氨基酸。经过核苷酸序列分 析表明，CD34抗原与任何其他已知细胞表面分子编码基因无明显的同源性。目前用来 从外周血、周围组织微血管中分离内皮前体细胞、血管内皮细胞的方法主要依赖于选择 ⑶34，进而再扩增富集这些细胞。根据血管内皮细胞表面表达⑶34的原理，还可以分离 和纯化血管内皮细胞(Endothelial Cell，EC)。Arts等从皮下脂肪提取微血管内皮细胞 (MicrovascularEndothelial Cell, MVEC)，以 Nexell 通用法作 CD34 抗体选择，经过分离、 培养和恢复MVEC，使MVEC富集到86 %。自从发现、纯化和标记抗CD34单克隆抗体以后，使利用流式细胞定量检测在外周 血或骨髓中的⑶34阳性造血干细胞成为可能。⑶34单克隆抗体识别⑶34抗原的不同表 位，这些表位根据他们对神经氨酸酶，木瓜蛋白酶和糖蛋白酶的敏感程度不同，可以分为三3类1类(对三种酶均敏感)；II类(对神经氨酸酶抵抗，对木瓜蛋白酶和糖蛋白酶敏感)； III类(对三种酶抵抗)，在正常造血干细胞中这些表位的分布不同，可能与造血干细胞的 分化，成熟和功能有关。这一个强大而标准化的⑶34分析系统的建立，极大地推动了⑶34 研究领域的迅速进步。例如，荧光素标记的单克隆抗体可用于CD34鉴定细胞，同时结合流 式细胞仪，为鉴定和计数CD34细胞提供了一个快速、定量、重复性好的方法，进而决定动员 干细胞及采集最佳时间。内皮细胞的CD34抗原可与L选择素结合，但造血干细胞上的CD34 抗原的配体尚未发现，此抗原在细胞粘附中起作用。尽管现已证实造血干细胞表达⑶34抗原，然而用其鉴别多能干细胞的工作相当 复杂且刚起步。近年利用⑶；34单克隆抗体显示血管EC的研究结果表明，⑶34为EC的最 敏感的特异性标记，优于EC的其他标记物。但是目前关于CD34的多克隆抗体报道罕见，特 别在家禽方面，造成了以家禽为模式生物进行科学研究的限制。
技术实现思路
本专利技术的目的为提供一种CD34部分多肽，及其在制备CD34多克隆抗体方面的应用。一种血管内皮细胞表面决定簇部分多肽，其中，其氨基酸序列为序列表中的序列 1。一种复合蛋白，是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，其中，所述多肽的氨基酸 序列为序列表中的序列1。本专利技术的复合蛋白，其中，载体蛋白是匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。一种免疫原，是复合蛋白和免疫佐剂的混合物；所述复合蛋白是多肽与载体蛋白 偶联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为序列表中的序列1。本专利技术的免疫原，其中所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。本专利技术的免疫原在制备多克隆抗体中的应用。与血管内皮细胞表面决定簇特异结合的多克隆抗体，是用免疫原免疫动物，采取 免疫后动物的血液，获得的血清；所述免疫原是复合蛋白和免疫佐剂的混合物；所述复合 蛋白是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为序列表中的序列1。本专利技术的多克隆抗体，其中所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。本专利技术的优点为提供了一种血管内皮细胞表面决定簇部分多肽，该多肽的特异性和敏感性好。本专利技术的另一个优点为使用该多肽所制备的多克隆抗体的特异性和敏感性较高， 使用该多肽制备多克隆抗体的方法，操作过程简单节省时间，节约经费。附图说明图1免疫组化检测SPF新西兰大耳白兔五回免疫后阳性血清图A图为相差图片， B图为相差与荧光叠加图片，C图为荧光图片。图2免疫组化检测SPF新西兰大耳白兔免疫前阴性血清图A图为相差图片，B图 为相差与荧光叠加图片，C图为荧光图片。图3免疫组化以PBS代替血清图A图为相差图片，B图为相差与荧光叠加图片，C 图为荧光图片。图4免疫印迹法检测检测SPF新西兰大耳白兔五回免疫后阳性血清图。具体实施例方式(一 )合成免疫原人工合成免疫多肽，其氨基酸序列为CQSSAHPSTHPSVHPSTH。人工合成对照多肽，其氨基酸序列为CLATSEVDQECLLLILDGN。对人工合成的多肽进行检测。结果表明，人工合成的免疫多肽为白色冻干粉末，分子量为1897. 03，HPLCO20nm， C18，线性梯度)检测纯度为90%。对照多肽为白色冻干粉末，分子量为2049. 34，HPLC(220nm, C18，线性梯度)检测 纯度为90%。(二)与鸡⑶34特异结合的多克隆抗体免疫多肽与载体蛋白按照质量比1 1偶联，形成多肽-载体复合蛋白，载体蛋白 可以是匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，本实施例为免疫多肽-KLH复合蛋白。对照多肽与KLH按照质量比1 1偶联，形成对照多肽-KLH复合蛋白。免疫多肽-KLH复合蛋白与费氏完全佐剂(Sigma)混合，制成免疫原。对照多肽-KLH复合蛋白与费氏完全佐剂(Sigma)混合，制成对照免疫原。用上述制备的免疫原和对照免疫原分别免疫SPF新西兰大耳兔。2本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种血管内皮细胞表面决定簇部分多肽，其特征在于，其氨基酸序列为序列表中的序列１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：关伟军，马月辉，李向臣，白春雨，赵倩君，何晓红，郑扬，冯宝刚，宫雪莲，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11