一种多肽HM-3的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种HM-3多肽制备方法，属于生物化学领域中的多肽技术领域，其以其以Fmoc-Asp(Otbu)-wang?resin或Fmoc-Asp(Otbu)-CTC?resin为起始原料，然后用保护氨基酸依次接二肽至十八肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得HM-3粗品。将粗品溶解，用制备型高效液相经过两次纯化，最后浓缩冻干得到纯品。该方法不仅保证了合成的效率，又提高了纯度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化学领域中多肽的合成和纯化方法，具体说是涉及多肽HM-3合成和纯化工艺。
技术介绍
传统肿瘤治疗化学药物由于其无选择的细胞毒性，对患者有较大的毒副作用，容易产生耐药性。目前抑制肿瘤血管生成来抑制肿瘤营养和转移的方法成为新的肿瘤治疗途径，其最大的潜力在于克服了耐药性。HM-3是一种血管生成抑制剂，其特征在于该血管生成抑制剂，是具有整合素、肝素亲和性和结合能力的多肽，对治疗胃癌，直肠癌，肝癌等有良好的效果。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，分为液相合成法和固相合成法。在液相合成中，每次接肽以后都要对产物分离纯化或结晶以便除去未反应的原料和副产物，这个步骤相当费时间且麻烦，损失也很大。固相合成法是液相合成为基础的，固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成在多肽合成中，许多杂质显示了与产物相似的性质，随着肽链的增长，分离的难度也增大，因此纯化的方法和工艺显得很重要。近年来，多肽的分离纯化方法很多，例如毛细管电泳法，高效液相法和超滤法等，其中高效液相色谱法应用较为广泛，气分离效果好，速度快，样品容量大，回收率高，已成为生物多肽的主要分离纯化方法之一。
技术实现思路
本专利技术提供了一种多肽HM-3合成工艺及纯化方法。本专利技术的技术方案为一种多肽 HM-3 的制备方法，其以 Riioc-Asp(Otbu)-Wang resin 或 Fmoc-Asp (Otbu) -CTCresin为起始原料，然后用保护氨基酸依次接二肽至十八肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得HM-3粗品。将粗品进行纯化，首先溶解，然后用制备型高效液相经过两次纯化，最后浓缩冻干得到纯品。其中反相制备液相色谱发所用的色谱柱是C18柱，流动相由乙腈和缓冲溶液组成，其特征是流动相进行梯度洗脱。所述的接肽(包括接二肽至十八肽)的步骤如下称取 Fmoc-Asp (Otbu)-wang resin 或 Fmoc—Asp (Otbu)-CTC resin 适量，佳J入玻璃砂芯反应柱中，加入CH2Cl2适量使树脂充分膨胀。每一克的Fmoc-Asp (Otbu)-wang resin 或 Fmoc-Asp (Otbu)-CTC resin 力口入 5 15mlCH2Cl2。a、脱帽加入六氢吡啶/DMF的脱帽液10 50mL，反应2 IOmin将脱帽液抽干， 中间用DMF洗涤一次，然后再加入一次脱帽液适量反应，脱去Fmoc保护基。b、洗涤将脱帽液抽干，用DMF洗涤树脂几次，充分洗净副产物。C、缩合将用于接肽的保护氨基酸和激活剂溶于DMF和缩合剂中，摇勻，并充分反应。d、洗涤将反应液抽干，用DMF充分洗涤树脂，洗净副产物。所述切肽的步骤如下把抽干的树脂装入圆底烧瓶中，加入切割液充分裂解合好的十八肽中间体，用砂芯漏斗将树脂与多肽分离，所述的裂解液的体积组成为三氟乙酸苯酚水苯甲硫醚EDT = 88 92 2. 5 3. 5 2. 5 3. 5 1. 5 2. 5 1. 5 2. 5。所述后处理步骤如下先加无水乙醚到切割液中将多肽析出，然后离心，把清液倒掉，然后再用无水乙醚洗涤多肽，抽干得多肽粗品。所述的纯化的步骤如下a、溶解称取粗品配制成5 20g/l的溶液，用0. 45 μ m的混合滤膜过滤。b、制备①一次纯化用5% 10%的乙腈和90% 95%的缓冲溶液，流速为 50ml/min lOOml/min下冲洗IOmin 20min平衡制备柱。用输液泵上样，采集基线，收集紫外波长220nm吸收值大于200mv的溶液，检验是否有样品。用梯度洗脱，乙腈的起始百分数为5 % 10 %，30 50min后乙腈的百分数为15 20 %。收集紫外波长220nm吸收值大于200mv的溶液，检测纯度大于95%的合并作为峰顶，待做二次分离纯化。②二次纯化将一次收到的峰顶旋转蒸发掉有机溶剂后用输液泵上样，用5% 10%的乙腈和90% 95% 的缓冲溶液。流速50 lOOml/min，并采集基线，收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，检测是否有样品冲出。用梯度洗脱，乙腈的起始百分数为5% 8%，30 50min后乙腈的百分数为15 18%。收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，通过检测纯度大于99%的作为合格。C、浓缩、过滤、冻干将合格溶液用旋转蒸发仪37°C减压浓缩，除去残留溶剂和注射用水。最后用0. 22um滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进行冷冻干燥。 所述的六氢吡啶/DMF的浓度为六氢吡啶占溶液体积的15% 25%。所述的多肽HM-3的制备方法，其特征在于所述的激活剂为HBTU、HOBT等。所述的多肽HM-3的制备方法，其特征在于所述的缩合剂为DIC、DIEA等。所述的多肽HM-3的制备方法，其特征在于所述的氨基酸原料、激活剂和缩合剂与树脂的投料摩尔比例为2 5 1。所述的缓冲溶液是含0. 5 2%。的三氟乙酸，含1 5%。的醋酸。其中所述的多肽HM-3的氨基酸序列见seq no. 1。本专利技术的优点在于1、Fmoc法裂解和脱侧链保护基时可采用弱酸。TFA为应用最广泛的弱酸试剂，它可以脱除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；条件温和、副反应较少。不足之处Arg侧链的Mtr很难脱除，TFA用量较大；无法除掉Cys的t-Bu等基因.也有采用强酸脱保护的方法如用HF 来脱除一些对弱酸稳定的保护基，如Asp、Glu、Ser, Thr的Bzl (苄基)保护基等，但是当脱除Asp的吸电子保护基时，会引起环化副反应。上述裂解液在实际使用时发现，得率很低， 最终纯化得率低于5%，对于工业大生产来说不适应。因此本专利技术针对裂解工艺进行了大量试验，发现TFA/苯甲硫醚/1,2-乙二硫醇苯酚/水=86/5/4/3/2。所裂解得到的粗品使用HPLC纯化进行了对比试验，采用该裂解液切割得粗品占HPLC色谱图的总峰面积的80%，最终纯化收率为22%。因此用此方案相对收率高，从而降低成本，而且切割液用的TFA量最少，也适当的能降低成本和降低污染。2、本专利技术针对激活剂和缩合剂的选择进行了摸索，常规的激活剂有TBTU，HBTU, Η0ΒΤ，缩合剂有DIC，DIEA。设计激活剂和缩合剂的不同组合，最终确定HBTU和DIC，HOBT 和DIEA作为两种激活剂缩合剂组合，因为得到的粗品经HPLC纯化的纯度高，在80%左右， 而且粗品量也多，收率大概在85%左右。3、本专利技术采用固相合成多肽，此方法，重复性高，可操作性强，污染少。4、本专利技术用WANG resin,相对树脂比较稳定，副反应少，工艺粗品峰型好点，纯化相对收率高，所以成本相对低点。用CTC resin反应受温度影响小，反应速率快。5、本专利技术使用反相高效液相法纯化多肽，使用梯度洗脱相对于等度洗脱来说，分离效果更好，分离过程中，保留时间合适，生产效率高，纯度高。具体实施例方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1一、合成称取F本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种多肽ＨＭ－３的制备方法，其以Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔｂｕ）－ｗａｎｇ　ｒｅｓｉｎ或Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔｂｕ）－ＣＴＣ　ｒｅｓｉｎ为起始原料，然后用保护氨基酸依次接二肽至十八肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、纯化即得ＨＭ－３，其特征在于切肽所用的裂解液按体积比为三氟乙酸∶苯酚∶水∶苯甲硫醚∶ＥＤＴ＝８８～９２∶２．５～３．５∶２．５～３．５∶１．５～２．５∶１．５～２．５。。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐寒梅，张弛，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84