本发明专利技术公开了一种血管内皮生长因子受体部分多肽及其应用。血管内皮生长因子受体部分多肽，其氨基酸序列为序列表中的序列1。所述多肽与载体蛋白偶联可形成复合蛋白。所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。复合蛋白和免疫佐剂混合的混合物可作为免疫原。本发明专利技术的免疫原免疫动物获得了较高效价的免疫血清，经ELISA检验效价高于1∶60000，并且免疫印迹法证明该免疫血清与鸡血管内皮生长因子受体结合的特异性较强，免疫血清能在细胞水平上检测鸡血管内皮生长因子受体的表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种血管内皮生长因子受体部分多肽及其应用。
技术介绍
迄今发现血管内皮生长因子(VEGF)受体家族包括具有两种信号转导途径的受 体酪氨酸激酶受体和非酪氨酸激酶受体，酪氨酸激酶受体包括Flt-I (fms-liketyrosine kinase)、KDR\Flk_l(kinase insert domain containing\fetal 1iverkinase)及 VEGFR-3, Flt-I 又称 VEGF 受体 1 (VEGFR-I)，KDR\Flk_l 又称 VEGF 受体 2 (VEGFR-2)，非酪 氨酸激酶受体包括肝素样分子、神经纤毛蛋白-1受体(NRP-I)和神经纤毛蛋白-2受体 (NRP-2)，其中KDR是VEGF的高亲和力受体，主要参与血管内皮细胞有丝分裂、增殖、迁移、 分化、微管形成等生命活动，是目前研究的热点。KDR在肿瘤血管形成过程中起着关键作用， 高表达于肿瘤新生血管内皮细胞及恶性程度高的肿瘤细胞，而正常组织中呈低表达。KDR特 异性地表达于血管内皮细胞，其表达水平与血管内皮细胞更新速度呈正相关。生理情况下 正常组织血管内皮细胞更新速度缓慢，KDR表达很低，肿瘤组织中的血管内皮细胞处于活跃 的增殖状态，增殖速度比正常组织血管内皮细胞快500倍，KDR表达很高。KDR的表达水平 可作为评估肿瘤生物学行为和预测肿瘤患者预后的指标。KDR的表达水平可以通过与KDR 特异结合的抗体进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种血管内皮生长因子受体部分多肽。本专利技术所提供的血管内皮生长因子受体(KDR)部分多肽，其氨基酸序列为序列表 中的序列1。本专利技术的血管内皮生长因子受体部分多肽，可用来制备免疫原，该免疫原免疫动 物可获得与KDR特异结合的多克隆抗体。对在动物体内产生免疫反应而言，大多数多肽的分子量都太小，将多肽与载体蛋 白如匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白等交联之后，不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性。因此，本专利技术还提供了 一种复合蛋白。本专利技术所提供的复合蛋白是所述多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白。本专利技术的复合蛋白，其中，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。在免疫动物时，为了增强免疫原性通常将复合蛋白与免疫佐剂混合。本专利技术所提供的免疫原，是所述复合蛋白和免疫佐剂的混合物。本专利技术的与血管内皮生长因子特异结合的多克隆抗体，是用免疫原免疫动物，采 取免疫后动物的血液，获得的血清；所述免疫原是复合蛋白和免疫佐剂的混合物；所述复 合蛋白是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为序列表中的序列 1。本专利技术的与血管内皮生长因子特异结合的多克隆抗体，其中，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。本专利技术的免疫原免疫动物获得了较高效价的免疫血清，经ELISA检验效价高于 1 60000，并且免疫印迹法证明该免疫血清与鸡血管内皮生长因子受体结合的特异性较 强，免疫血清能在细胞水平上检测鸡血管内皮生长因子受体的表达。附图说明图1为免疫印迹法检测免疫血清的特异性。图2为空白对照组激光共聚焦显微镜下显示结果的图片；A为相差图片，B为相差与荧光叠加图片，C为荧光图片。图3为对照血清组激光共聚焦显微镜下显示结果的图片；A为相差图片，B为相差与荧光叠加图片，C为荧光图片。图4为免疫血清组激光共聚焦显微镜下显示结果的图片；A为相差图片，B为相差与荧光叠加图片，C为荧光图片。具体实施例方式实施例1、与KDR特异结合的多克隆抗体(一 )合成免疫原人工合成免疫多肽，其氨基酸序列为CAQEASPTLPRVHGLVHD。人工合成对照多肽，其氨基酸序列为AFGQVIEADAFGIDKTATC。对人工合成的多肽进行检测。结果表明，人工合成的免疫多肽为白色冻干粉末，分子量为1931. 13,HPLC(220nm, C18，线性梯度)检测纯度为98%。对照多肽为白色冻干粉末，分子量为1957. 19，HPLC(220nm, C18，线性梯度)检测 纯度为95%。( 二)与鸡血管内皮生长因子受体特异结合的多克隆抗体免疫多肽与载体蛋白按照质量比1 1偶联，形成多肽-载体复合蛋白，载体蛋白 可以为匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，本实施例为免疫多肽-KLH复合蛋白。对照多肽与KLH按照质量比1 1偶联，形成对照多肽-KLH复合蛋白。免疫多肽-KLH复合蛋白与费氏完全佐剂(Sigma)混合，制成免疫原。对照多肽-KLH复合蛋白与费氏完全佐剂(Sigma)混合，制成对照免疫原。用上述制备的免疫原和对照免疫原分别免疫SPF新西兰大耳兔。20周龄以内，2. 5-3Kg的SPF新西兰大耳兔，随机分成两组，免疫多肽组和对照多 肽组，每组2只。免疫多肽组注射免疫原，对照多肽组注射对照免疫原。免疫的具体过程如下第1周，每天多点背部皮下注射免疫SPF新西兰大耳兔一次，每只SPF新西兰大耳 兔注射免疫多肽-KLH复合蛋白或对照多肽-KLH复合蛋白的总量为0. Img ；第2周，对SPF新西兰大耳兔不做任何处理；第3周-第7周，每天多点背部皮下注射免疫SPF新西兰大耳兔一次，每只SPF新 西兰大耳兔注射免疫多肽-KLH复合蛋白或对照多肽-KLH复合蛋白的总量为0. Img ；第7周免疫结束，处死SPF新西兰大耳兔，从耳部及心脏采取150ml血液，用促凝 剂促凝，3000转离心20分钟。免疫多肽组获得免疫血清01和02。对照多肽组获得对照血清01和02。ELISA检测免疫血清和对照血清的效价，具体方法如下1)上述鸡血管内皮生长因子受体蛋白用PBS配成lOOyg/ml的溶液，按100 μ 1/ 每孔加入96孔酶标板，4°C过夜吸附；2)次日将过夜包被的酶标板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3% (质量百分比)BSA (用PBS配制不含Tween20,)封闭，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5小时；3)用PBS彻底洗2)中的沉淀4次后加入免疫血清或对照血清(用PBS按体积比 为 1 100、1 500、1 2500、1 12500 或 1 62500 稀释)，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5 小 时；4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加二抗(羊抗兔IgG用PBS按体积比为1 10000 稀释)，100 μ 1/每孔，37°C，lhr ；5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加AP显色液P-NPP (2mg/ml)，80 μ 1/每孔，避光反 应，加等体积0. 2Μ NaOH终止反应。6)取100 μ 1 5)中终止反应后的溶液100 μ 1，用酶标仪测定405nm下的OD值。实验重复三次，结果以三次的平均值表示。 血清效价检测结果如表1和图1所示；表1.血清效价检测结果权利要求1.一种多肽，其氨基酸序列为序列表中的序列1。2.一种复合蛋白，是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为 序列表中的序列1。3.根据权利要求2所述的复合蛋白，其特征在于所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛 血清白蛋白。4.一种免疫原，是复合蛋白和免疫佐剂的混合物；所述复合蛋白是多肽与载体蛋白偶 联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为序列表中的序列1。5.根据权利要求4所述的免疫原，其特本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多肽，其氨基酸序列为序列表中的序列１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马月辉，关伟军，侯玲玲，白春雨，浦亚斌，冯宝刚，李方华，王会，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11
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