检测内皮细胞大量钙积累性死亡的方法技术

利用钙离子特异性染料评估和预测各种处理对样品中所包含细胞类型的活力的影响，其中所述染料检测发生大量钙积累性死亡的内皮细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种与钙离子水平提高相关的内皮细胞特异性凋亡的推断(implications)和应用。这种特殊的死亡形式,大量I丐积累性死亡(MCAD,massivecalciumaccumulation death),是治疗抗血管新生剂敏感肿瘤及视网膜新生血管形成中所希望的结果。防止MCAD的方法和试剂可用于治疗或预防糖尿病性血管病、动脉粥样硬化和心脏瓣膜钙化症。本专利技术可用于评估治疗肿瘤的候选药物的效果，尤其是特异性和直接抑制新生血管生长的那些药物，也可用于鉴定保护剂。
技术介绍
组织(正常组织和肿瘤组织)尺寸增长时，需要形成微毛细管(新生血管)来为维持组织生长提供营养。这些微毛细管的组成中的最主要成分是内皮细胞，但也包含相关的间充质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和周细胞。血管新生不仅在正常过程如伤口愈合中很重要，而且在疾病如癌症、银屑病、糖尿病、类风湿性关节炎、和衰老相关的黄斑变性中也很重要。需要用于正常及患病组织中微毛细管体外研究的改良方法。Staton等人发表了关于现有已知方法的总结，“Current `Methods for Assaying Angiogenesis in vitro andinvivo”( “体内外分析新生血管生成的现有方法”)Int J Exp Path (2004) 85:233 248。体内模型虽然有用，但很繁琐。体外模型较为简便，但真实性与相关性也较低。具体而言，需要用于预测靶向肿瘤微脉管系统的抗癌药物及其它治疗的活性的改良方法。例如，贝伐单抗(Avastin )是一种FDA批准的靶向肿瘤微脉管系统的抗癌药物。治疗10个月所需Avastin 的批发价格超过$40000，但只有相对小百分比的病人实质获益。如 Ince 等人所述，“Association of k-ras, b-raf, and p53 Status withthe TreatmentEffect of Bevacizumab, ” ( “k_ras、b_raf 和 p53 状态与贝伐单抗疗效的关联”)，J NatlCancer Inst (2005) 97:981-989,鉴定可预测哪些病人最有可能响应此类治疗的生物标记物受到了人们的强烈关注。最常用的体外方法包括分离和培养内皮细胞。一旦细胞得以培养，利用各种细胞增殖和/或细胞死亡终点，即可研究药物作用(或其它干扰)。细胞增殖终点的例子包括放射性胸苷掺入、细胞计数、BrdU掺入和克隆形成率。细胞死亡终点的例子包括检测细胞ATP、MTT的线粒体还原、二乙酸荧光素的代谢和细胞内俘获(及其损耗)、用染料排斥法检测细胞膜完整性的缺失、以及凋亡的更特异性检测方法，如TUNEL检测法或胱冬酶表达测定法。在一些例子中，通过将预先分离的内皮细胞与预先分离的其它细胞共培养，研究了药物对于不同细胞群的药效差异。其它的体外方法基于器官培养。(参见例如，Staton等，同上)这些器官包括大鼠主动脉环、小鸡主动脉弓、猪颈动脉、胎盘静脉盘和胎小鼠骨外植体。无细胞培养、无器官培养，这些研究和预测贝伐单抗效果的方法也已被Ince等人公开，J Natl Cancer Inst (2005)同上。Ince尝试将k-ras、b_raf和p53状态与贝伐单抗治疗效果联系起来，但是得出了它们“无法鉴定更可能响应贝伐单抗治疗的转移性结直肠癌患者的任何亚组”的结论。在他们的讨论中，Ince等人提到:“迄今，几乎没有研究评价过生物标记物在预测临床上哪些病人更可能响应抗新生血管治疗中的潜在效用”，并且仍未发现可预测临床益处的标记物。这些作者提出:“使用总结所有血管形成调节物效果的生物标记物比分析单个生长因子或信号诱导通路更利于预测患者结果”，但是并没有提出任何能用于该目的的体外方法。相反，他们指出了目前的研究中采用患者自身作为实验模型来预测他们自己的结果。在这些研究中，将贝伐单抗(和/或其它疗法)尝试性给予患者，然后通过外部诊断扫描(例如，MRI)和/或治疗后肿瘤活检，以及疗效的组织学评估来评价“早期”治疗效果(例如，Willett等人，Nature Med(2004) 10:145147.)。所述方法存在很多明显缺点，包括治疗的花费、使患者接触最终无效治疗的 潜在毒性、以及诊断研究的花费(例如:MRI)。此类研究也不具备同时测试多种不同的治疗而不给患者带来风险的能力，而采用体外方法则有可能实现该能力。PCT公开W02007/075440是本文所述申请人所做的工作，其描述了使用显微观察不被活细胞接受而被非活细胞吸收的染料(尤其是固绿)的吸收情况，评估对内皮及非内皮细胞混合物或微团聚体的处理效果。申请人观察到死亡内皮细胞可通过其外观与存活或死亡肿瘤细胞或非内皮细胞区分开。然而，这种差别依赖于在不论实施何种疗法非内皮细胞本身都不会被杀死的情况下更易察觉的观察。在该情况下，可采用能被活细胞摄入的第二指示剂染料将活细胞与死亡内皮细胞中区别出来，产生蓝莓薄饼状特征，其中死亡内皮细胞显示为粉红背景下的“蓝莓”。其它出版物对此进行了总述，也代表了申请人的工作，包 ffeisenthal, L- M.等人，J.1ntern.Med.(2008)264:275 287; Weisenthal, L.，等人，ASCO2008 Breast CancerSymposium(ASCO 2008乳腺癌专题论丛)，华盛顿特区，摘要编号166 ；以及 Weisenthal, L,等，J.Clin.0ncol.(2010)28:增刊:摘要 E13617。即便非内皮细胞在处理中被杀死，其仍可得以辨别。只有死亡的内皮细胞在固绿染色下具有发生折射的、浓染的、且呈蓝黑色的易区分形貌，而所有死亡的非内皮细胞则呈现较淡的蓝色。在随后的PCT公开中，同样也是当前申请人的工作，公开号W02009/143478，利用内皮细胞响应特异于内皮细胞的毒性试剂所呈现的不同形貌来检测和量化循环内皮细胞作为健康指标。同样，利用这些死亡内皮细胞的形貌进行该评估。使用这种方法，还发现亚毒性血液水平的乙醇和/或DMSO是用于治疗不利新生血管的有用佐剂。虽然在上述参考的PCT公开中 描述的方法是有效的，其依然难适应高通量形式，因为如果非内皮细胞未受处理影响，内皮细胞与非内皮细胞之间的对比更为强烈。本专利技术提供了解决该问题的方法，通过该方法不论非内皮细胞本身在处理中有没有受到负面影响，在处理中受到负面影响的内皮细胞易于与所述非内皮细胞区分开。此外，已发现某些试剂使内皮细胞发生特定类型的细胞死亡，而非特异性内皮细胞死亡也受到不同非特异性试齐U的影响。本专利技术的方法依赖于使用钙离子敏感性染料。将钙离子与内皮细胞死亡联系起来，特别是在本文中将内皮细胞与肿瘤联系起来，使所述新技术成为可能。过去曾在心血管系统中观察到的钙积累现象，但是并没有将其与特定类型的内皮细胞死亡特别联系起来。例如，Spyridopoulos,1.等人，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.(2001) 21:439 444 报道了乙醇以钙依赖机制增强氧留醇诱导的人内皮细胞凋亡；阻滞钙内流则消除这种乙醇介导的毒性增强。还已知，氧化的LDL通过一种钙依赖途径诱导培养的人内皮细胞发生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.13 US 61/323,768;2011.01.07 US 61/460,723;1.一种从非特异性凋亡的内皮细胞中辨别大量钙积累性死亡(MCAD)内皮细胞的方法，所述方法包括使含有内皮细胞的样品接触至少一种钙离子特异性染料， 其中，所述样品中的个体细胞可被辨识，以及 确定被所述染料亮染的内皮细胞的有、无或数量； 由此，由被染料亮染的细胞的存在表明这些细胞由MCAD导致细胞死亡。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品仅包含内皮细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品既包含内皮细胞又包含非内皮细胞。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为微团聚体形式。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述细胞沉积到供显微检测的表面上。6.一种测定处理对内皮细胞中MCAD的影响能力的方法，所述方法包括 使至少含有活内皮细胞的样品接触所述处理； 其中，所述样品中的个体细胞可被辨识， 使所述样品接触至少一种钙离子特异性染料； 测定被所述染料亮染的内皮细胞的有、无或数量； 由此，观察到被所述染料亮染的细胞表明所述处理对所述亮染细胞中的MCAD有影响。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品仅包含内皮细胞。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品既包含内皮细胞又包含非内皮细胞。9.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述样品为微团聚体。10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉瑞·M·韦森赛尔，
申请(专利权)人：拉瑞·M·韦森赛尔，
类型：
国别省市：