一种铅离子可视化检测方法技术

本发明专利技术公开了一种铅离子快速可视化检测方法。该方法将基链和酶链混合杂交后形成GR‑5 DNA酶，加入氧化石墨烯处理去除未反应的游离单链核酸，排除假阳性影响，在金标垫上喷有两种金标探针，加入通过预处理的待测样品GR‑5 DNA酶在rA处被切开后得到的两条链，通过层析作用与金标探针和检测线上的核酸序列形成夹心结构，从而被固定到检测线上显色，多余的游离核酸被固定到质控线上显色。根据检测线显色强度得到铅离子浓度。本发明专利技术可以在室温15min内完成铅离子的检测，对铅离子的最低检测限能够达到0.05nM，具有灵敏度高，特异性强，不受其他二价金属离子干扰，操作简单易行，可直接应用于环境中铅离子的检测。

Lead ion visual detection method

The invention discloses a method for quickly detecting lead ions. The radical chain and enzyme chain hybrid formation GR 5 DNA enzyme, adding graphene oxide to remove unreacted free single stranded nucleic acid, eliminate false positive effects in the gold standard pad is sprayed with two gold standard probe, joined by two strands of pretreatment of the sample GR 5 DNA enzyme is cleaved in rA after the formation of the sandwich structure by nucleic acid sequence chromatogaphy and gold probes and detection line, which is fixed to the detection line color, free nucleic acid excess is fixed to the control line color. The concentration of lead ion was obtained according to the color intensity of the test line. The invention can complete the detection of lead ions at room temperature in 15min, the lowest detection of lead ions on the limit can reach 0.05nM, which has high sensitivity, strong specificity, no other two valence metal ion interference, simple operation, can be directly applied to the detection of lead ion in the environment.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于金属离子检测领域，更具体地，涉及一种铅离子快速可视化检测方法。
技术介绍
铅作为一种重金属元素，能够造成环境的污染并危害人类的身体健康。铅对人机体的损害呈多系统性、多器官性，会对骨髓造血系统、心血管系统、免疫系统、神经系统和消化系统等造成毒害作用；其作为一种中枢神经系统毒物，对儿童的神经系统损害更为严重。铅排放到环境中后大部分会进入土壤中，再通过粮食和蔬菜等进入人体内。许多国家均对环境及食品中铅含量做出了规定。如中国《土壤环境质量标准》对农田II类土壤中的铅离子限定最高浓度为50nM，美国环保局对饮用水中的铅离子限定为72nM。因此，建立高灵敏度的铅检测方法十分重要。目前常用的铅检测方法有石墨炉原子吸收光谱法、荧光光谱法、紫外分光光度法、电化学分析法、电感耦合等离子体质谱法和双硫腙比色法等。这些方法往往都有较好的灵敏度，可满足上述标准的检测；然而这些方法几乎都需要昂贵的仪器和相当专业的操作，只适合在实验室内完成检测，因此研究简便的高灵敏度铅离子快速检测方法十分重要。金标层析试纸由于具有方便快捷、成本低和灵敏度高等优点，已被广泛用于各种对象的检测，目前已有研究者基于DNA酶研究了铅的检测试纸。DNA酶是一类能够通过体外合成得到的具有催化活性的DNA片段，一些DNA酶被发现对某些金属离子可特异性地产生响应，其中尤以对铅离子响应的8-17DNA酶最引人瞩目。在铅离子存在的情况下，其基链可在rA处被切开，据此前人开发出了多种溶液中铅离子检测技术。然而进一步的研究发现，该DNA酶除了对铅离子有较特异的响应外，Zn2+，Mn2+,Cr2+和Co2+对该酶存在一定的干扰。另外，在基于DNA酶的铅离子层析试纸研究中，由于溶液中往往存在单链存留，它们会结合试纸上的互补探针从而造成假阳性的结果，干扰铅离子的检测，影响检测结果的准确性。再者，现有的层析试纸的金标垫上仅喷涂有一种金标探针，酶切后产生片段的使用效率低，同时检测灵敏度不高。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种铅离子快速可视化检测方法，其目的在于通过采用氧化石墨烯处理DNA酶，吸附未反应的游离单链核酸，同时结合双金标探针检测技术，提高酶切后产生片段的使用效率，进而提高检测灵敏度，由此解决现有技术基于DNA酶的铅离子层析试纸检测中出现的假阳性结果干扰铅离子的检测、检测灵敏度低以及其他杂质离子干扰检测结果的技术问题。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种铅离子快速可视化检测方法，所述检测方法包括上样工作液的制备步骤，所述上样工作液的制备采用单链DNA吸附剂吸附GR-5DNA酶的基链GR-5S和酶链GR-5E反应完全后游离的单链，用于消除游离的单链在铅离子分析过程中产生的假阳性干扰。优选地，所述单链DNA吸附剂为氧化石墨烯或纳米金，优选为氧化石墨烯。优选地，所述GR-5DNA酶的基链GR-5S、酶链GR-5E和氧化石墨烯的质量浓度比为1:0.3～2:16.6～83.2，优选为1:1.5:52。优选地，所述检测方法还包括金标探针的制备步骤，所述金标探针的制备按照如下步骤进行：将巯基修饰的第一单链DNA加入到纳米金溶液中制备得到第一金标探针，将巯基修饰的第二单链DNA加入到纳米金溶液中制备得到第二金标探针。优选地，所述检测方法具体包括如下步骤：1)金标探针的制备：第一金标探针的制备：将巯基修饰的第一单链DNA加入到纳米金溶液中，反应24h，再加入磷酸盐缓冲液和十二烷基磺酸钠，室温混合30min，加入氯化钠室温老化2天，4℃离心25min，弃上清，沉淀用重悬缓冲液重悬，得到制备好的第一金标探针；第二金标探针的制备：将巯基修饰的第二单链DNA加入到纳米金溶液中，反应24h，再加入磷酸盐缓冲液和十二烷基磺酸钠，室温混合30min，加入氯化钠室温老化2天，4℃离心25min，弃上清，沉淀用重悬缓冲液重悬，得到制备好的第二金标探针；2)金标垫的制备：将玻璃纤维膜用金标垫处理缓冲液浸泡处理0.5h，然后在37℃干燥1h，然后用金标喷金仪将步骤1)制备得到的第一金标探针和第二金标探针按照摩尔比0.25～4:1，优选为2:3，固定至所述玻璃纤维膜上，37℃干燥1h，得到制备好的金标垫；所述喷金仪的喷金浓度为4μL/cm；3)检测线和质控线的制备：用划膜仪在硝酸纤维素膜上以1μL/cm的量划线，检测线上固定第三生物素探针和第四生物素探针，质控线上固定第五生物素探针和第六生物素探针，所述检测线和质控线之间的距离为3～6mm；4)上样工作液的制备：GR-5DNA酶的基链GR-5S和酶链GR-5E溶于缓冲溶液中，95℃水浴5min，缓慢冷却至室温，加入氧化石墨烯溶液混合均匀，反应0.5～2h，优选1h，离心去除氧化石墨烯，取上清液作为上样工作液；所述GR-5DNA酶的基链GR-5S、酶链GR-5E和氧化石墨烯的质量浓度比为1:0.3～2:16.6～83.2，优选为1:1.5:52；5)待测样品的分析：取步骤4)得到的上样工作液，加入待测样品，得到上样待测液，将上样待测液滴在样品垫上，层析反应5min，将5×SSC加入样品垫清洗试纸条，15min后试纸条的检测线和质控线能看到红色的条带，条带强度用试纸条图像分析仪分析灰度值，通过标准曲线计算待测样品中铅离子的浓度。优选地，步骤(1)所述纳米金溶液中纳米金的颗粒尺寸为13～35nm。优选地，步骤(4)所述缓冲溶液为PBS、HEPES、Tris-Ac或柠檬酸钠缓冲溶液，优选为柠檬酸钠缓冲溶液，进一步优选为5×的柠檬酸钠缓冲溶液。优选地，步骤(4)所述离心转速不低于10000rpm，离心时间不低于10min。按照本专利技术的另一个方面，提供了一种铅离子金标层析试纸条，所述金标层析试纸条包括依次搭载在底板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫的上样工作液为GR-5DNA酶的基链GR-5S和酶链GR-5E互补配对后经氧化石墨烯吸附了游离单链的铅离子的溶液；所述金标垫固定有第一金标探针和第二金标探针；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上固定有第三生物素探针和第四生物素探针，所述质控线上固定有第五生物素探针和第六生物素探针。优选地，所述GR-5DNA酶的基链GR-5S序列一部分与第一金标探针序列互补，一部分与第三生物素探针序列互补，形成夹心结构，用于检测线上的显色，所述GR-5DNA酶的酶链GR-5E序列一部分与第二金标探针序列互补，一部分与第四生物素探针序列互补，形成夹心结构，用于检测线上的显色。总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。(1)本专利技术通过对杂交形成DNA酶后利用石墨烯处理样品，将游离的单链基本清除而对DNA酶活性并无影响，有效地排除了假阳性结果的干扰；(2)通过在层析试纸的金标垫上喷涂上两种金标探针，提高了酶切后产生片段的使用效率，同时获得了更高的检测灵敏度；本专利技术在其铅离子浓度检测范围内，待测样品溶液加到样品垫上，15min后检测线能够得到肉眼可见的红色条带，本专利技术金标层析试纸实现了对铅离子的高灵敏快速检测，检测限达0.05nM，可满足相关标准的检测要求；(3)本专利技术的金标层析试纸的单次检测成本约为1.8元，成本很低，具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铅离子快速可视化检测方法，其特征在于，所述检测方法包括上样工作液的制备步骤，所述上样工作液的制备采用单链DNA吸附剂吸附GR‑5DNA酶的基链GR‑5S和酶链GR‑5E反应完全后游离的单链，用于消除游离的单链在铅离子分析过程中产生的假阳性干扰。

【技术特征摘要】
1.一种铅离子快速可视化检测方法，其特征在于，所述检测方法包括上样工作液的制备步骤，所述上样工作液的制备采用单链DNA吸附剂吸附GR-5DNA酶的基链GR-5S和酶链GR-5E反应完全后游离的单链，用于消除游离的单链在铅离子分析过程中产生的假阳性干扰。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单链DNA吸附剂为氧化石墨烯或纳米金，优选为氧化石墨烯。3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述GR-5DNA酶的基链GR-5S、酶链GR-5E和氧化石墨烯的质量浓度比为1:0.3～2:16.6～83.2，优选为1:1.5:52。4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括金标探针的制备步骤，所述金标探针的制备按照如下步骤进行：将巯基修饰的第一单链DNA加入到纳米金溶液中制备得到第一金标探针，将巯基修饰的第二单链DNA加入到纳米金溶液中制备得到第二金标探针。5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括如下步骤：1)金标探针的制备：第一金标探针的制备：将巯基修饰的第一单链DNA加入到纳米金溶液中，反应24h，再加入磷酸盐缓冲液和十二烷基磺酸钠，室温混合30min，加入氯化钠室温老化2天，4℃离心25min，弃上清，沉淀用重悬缓冲液重悬，得到制备好的第一金标探针；第二金标探针的制备：将巯基修饰的第二单链DNA加入到纳米金溶液中，反应24h，再加入磷酸盐缓冲液和十二烷基磺酸钠，室温混合30min，加入氯化钠室温老化2天，4℃离心25min，弃上清，沉淀用重悬缓冲液重悬，得到制备好的第二金标探针；2)金标垫的制备：将玻璃纤维膜用金标垫处理缓冲液浸泡处理0.5h，然后在37℃干燥1h，然后用金标喷金仪将步骤1)制备得到的第一金标探针和第二金标探针按照摩尔比0.25～4:1，优选为2:3，固定至所述玻璃纤维膜上，37℃干燥1h，得到制备好的金标垫；所述喷金仪的喷金浓度为4μL/cm；3)检测线和质控线的制备：用划膜仪在硝酸纤维素膜上以1μL/cm的量划线，检测线上固定第三生物素探针和第四生物素探针，质控线上固定第五生物素探针和第六生物素探针，所述检测线和质控...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵元弟，王海波，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42