检测α-葡聚糖的金标试纸及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测α-葡聚糖的金标试纸及检测方法，包括底板，底板上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫。在硝酸纤维素膜上设有检测线抗原和质控线抗体，在金标垫上设有金标抗体。根据胶体金免疫层析试验(GICA)原理制成，选取抗α-葡聚糖特异性单克隆抗体，采用竞争抑制免疫层析测α-葡聚糖。应用本发明专利技术试纸检测α-葡聚糖，特异性强，灵敏度高，操作简单、方便、快捷，不需要特殊仪器设备和专业培训，结果明晰易辨，经济实用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种半定量检测α-葡聚糖的金标试纸，可广泛应用于制糖、医疗等行业中。
技术介绍
α-葡聚糖(dextran)又称右旋糖酐，是一类D-吡喃葡萄糖的聚合物的总称，通过α-1,6糖苷键形成主链，少量的支链部分则由α-1,2,α-1,3和α-1,4糖苷键形成。分子式为(C6H10O5)n，分子量一般由数万到数百万，从可溶性小分子到不可溶的高分子，呈胶粘状，粘度随分子量和浓度的增加而增加。α-葡聚糖呈白色粉末状，无臭、无味，通常可溶于水、蔗糖溶液、氯化钠溶液中，溶解性随分子量和浓度的增加而下降。不溶于乙醇，常温稳定，加热逐渐变色或分解。用稀酸水解后，得部分解聚产物；若长时间水解，可得葡萄糖。右旋糖酐经碱性降解反应，产物的粘度随水解时间的长短而显著不同。α-葡聚糖是最早发现的微生物多糖，是世界上第一个工业化生产的微生物多糖，也是美国FDA批准的第一种可用于食品的微生物胞外多糖。在甘蔗制糖生产过程中出现的α-葡聚糖，俗称“蔗饭”。新鲜甘蔗中α-葡聚糖的含量很少，几乎为零。但甘蔗如受到刀伤或压伤、病虫害、火烧、霜冻或在收割后放置长时间，就会受到肠膜明串珠菌(Leuconostocmesnteroides)、链球菌属(Streptococcus)等微生物的感染而形成葡聚糖。这些微生物在适宜的温度和湿度下，能够分泌葡聚糖蔗糖酶（dextransucrose），催化蔗糖生成葡萄糖并聚合而生成多糖体，从而产生α-葡聚糖。从蔗汁到精制产品，制糖工艺过程自始至终存在着α-葡聚糖引起的不良影响。蔗汁中α-葡聚糖的存在意味着糖分转化损失，粘度增大，澄清、过滤、蒸发、煮糖（结晶）、分蜜受影响，收回降低，成本增加，产品质量下降，影响产品的适用性。因此，α-葡聚糖的监测成为糖厂生产控制的一个重要技术。制糖工业中α-葡聚糖的测定一般可用Haze/ICUMSA法、Robert's铜法、PoticalActivityLtd.DASA法、酶解法等，但这些方法都有较大的局限性，如准确度不高、操作繁琐、不适用所有糖品等缺点。其中测定α-葡聚糖的两个主流方法，HAZE法和Roberts方法，或者基于这两种原理的衍生方法，都属于化学测定法。这两种测试方法都要利用到α-葡聚糖在酒精溶液中沉淀的特性。α-葡聚糖的这些定量测定方法在长期以来的应用中存在可靠性、精确性、特异性均不高，价格昂贵和操作繁琐费时的缺点。而高效液相色谱法，则存在着仪器设备要求高，测试时间长，样本处理难的问题。胶体金免疫层析技术作为一种检测技术，其特点是方便快捷，除少量试剂外无需任何仪器设备，几分钟即可肉眼观察结果。胶体金试纸条的样品前处理简单，抗干扰能力强，能满足分析要求，适用于大量样品的定性和半定量初筛。本专利技术的半定量检测α-葡聚糖的胶体金试纸条具有ELISA方法的高灵敏度，大幅降低检测成本。对于在制糖行业中便捷、准确检测原料、中间物料、产品及副产品中的α-葡聚糖是很有意义的。检索结果表明，尚未有半定量检测α-葡聚糖浓度的方法，也没有利用胶体金法对α-葡聚糖进行半定量检测的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测α-葡聚糖的金标试纸及检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种检测α-葡聚糖的金标试纸，其包括底板，底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜以及吸样垫；在金标垫上包被有胶体金标记的抗α-葡聚糖的单克隆抗体或抗α-葡聚糖的多克隆抗体。反应膜位于金标垫一端设有检测区，远离金标垫一端设有质控区，所述检测区上设置了1条或多条互相平行的检测线，检测线上包被有α-葡聚糖-蛋白交联物。所述质控区设置有质控线，质控线上包被有羊抗鼠抗体IgG。所述α-葡聚糖-蛋白交联物的制备方法为：1）将α-葡聚糖与蛋白混合，用水溶解，冷冻干燥，研磨成粉；2）将粉末置于50～60℃的恒温，反应至少3天，得到α-葡聚糖-蛋白交联物。作为优选的，所述蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白中的一种。作为优选的，所述α-葡聚糖的分子量在10～2000kDa。所述抗α-葡聚糖的单克隆抗体的制备方法如下：1）将α-葡聚糖-蛋白交联物与佐剂混合，乳化，注射到动物体内；2）选取血清效价高的动物体，取其脾细胞制成悬液，并与对数生长期的瘤细胞混合，介导融合、筛选得到可以分泌α-葡聚糖特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株；3）使用杂交瘤细胞生产得到α-葡聚糖特异性单克隆抗体或使用腹水法生产得到α-葡聚糖特异性单克隆抗体。作为优选的，所述抗α-葡聚糖的单克隆抗体由杂交瘤细胞株D9分泌得到，所述杂交瘤细胞株D9已于2010年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2010107。一种半定量检测α-葡聚糖的试剂盒，包括外盒体和盒内支架，所述盒内支架上设置有试纸条凹槽可放置金标试纸。作为优选的，所述盒内支架上还设置有若干试剂管孔，孔内放置有试剂管，试剂管中分别盛装的试剂包括α-葡聚糖标准品溶液、样品稀释液。本专利技术检测α-葡聚糖的金标试纸的原理是：用胶体金标记抗α-葡聚糖的单克隆抗体，将该金标抗体包被于金标垫上。在检测线上包被有一定量的α-葡聚糖-蛋白交联物。当将待检样品到达金标垫后，若样品中含有一定量的α-葡聚糖时，则α-葡聚糖会与胶体金标记的抗体结合，从而抑制金标抗体与检测线上的抗原结合，无法聚集在检测线。若样品中所含的α-葡聚糖低于一定的量，不足以与全部的胶体金标记的抗体结合，则剩余未结合的金标抗体将与检测线上的抗原结合，聚集在检测线。通过在试纸条上设置多条间隔的检测线，可以实现α-葡聚糖的半定量检测。制作该试纸条时，通过确定各检测线上包被的α-葡聚糖-蛋白交联物的量，限定每条检测线只能够结合一定量的胶体金标记抗体。距离胶体金垫由近到远，检测线显色时所代表的α-葡聚糖含量依次减少。根据检测结果中出现检测线的数量，判断样品中α-葡聚糖的浓度范围。附图说明图1为本专利技术检测α-葡聚糖的金标试纸结构示意图（1为样品垫，2为金标垫，3为反应膜，4为检测线，5为质控线，6为吸样垫）；图2为检测结果示意图（α-葡聚糖浓度小于5ng/ml）；图3为检测结果示意图（α-葡聚糖浓度为5-20ng/ml）；图4为检测结果示意图（α-葡聚糖浓度为20-50ng/ml）；图5为检测结果示意图（α-葡聚糖浓度大于50ng/ml）。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1：α-葡聚糖金标试纸条的制备方法1.胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。取50ml0.1mg/ml的氯金酸溶液，100r/min搅拌，加热至沸腾，加入2ml10mg/ml柠檬酸钠溶液，保持原有的反应温度和搅拌速度，继续沸腾反应5min，至溶液颜色刚刚变为清亮橘红色后停止反应。冷却，并置于棕色瓶中4℃避光保存。经电镜检测，胶体金粒径为10-15nm。2.α-葡聚糖和BSA、OVA交联物的制备将α-葡聚糖DextranT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测α‑葡聚糖的金标试纸，其包括底板，底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜以及吸样垫；在金标垫上包被有胶体金标记的抗α‑葡聚糖的单克隆抗体或抗α‑葡聚糖的多克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种检测α-葡聚糖的金标试纸，其包括底板，底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜以及吸样垫；
在金标垫上包被有胶体金标记的抗α-葡聚糖的单克隆抗体或抗α-葡聚糖的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征在于，所述反应膜位于金标垫一端设有检测区，远离金标垫一端设有质控区，所述检测区上设置了1条或多条互相平行的检测线，检测线上包被有α-葡聚糖-蛋白交联物。
3.根据权利要求2所述的金标试纸，其特征在于，所述质控区设置有质控线，质控线上包被有羊抗鼠抗体IgG。
4.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征在于，所述α-葡聚糖-蛋白交联物的制备方法为：
1）将α-葡聚糖与蛋白混合，用水溶解，冷冻干燥，研磨成粉；
2）将粉末置于50～60℃的恒温，反应至少3天，得到α-葡聚糖-蛋白交联物。
5.根据权利要求4所述的金标试纸，其特征在于，所述蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白中的一种。
6.根据权利要求4所述的金标试纸，其特征在于，所述α-葡聚糖的分子量在10～2000kDa。
7.根据权利要求1所述的金标试纸，其特征在于，所述抗α-葡聚糖的...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁达奉，曾练强，黄曾慰，马步，柳颖，常国炜，
申请(专利权)人：广州甘蔗糖业研究所，广西农垦糖业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44