造血干细胞的体外扩增培养方法技术

本发明专利技术涉及一种造血干细胞的体外扩增培养方法，获取造血干细胞；采用小分子化合物对造血干细胞进行体外扩增培养；其中，所述小分子化合物包括小分子抑制剂和小分子抗氧化剂。通过小分子抑制剂使得造血干细胞能够一直处于增殖不分化的状态；而小分子抗氧化剂，也可消除造血干细胞在增殖过程中产生的自由基，对细胞起到保护作用，使得造血干细胞在增殖的同时也能够保持其细胞活性，有利于提高造血干细胞的扩增率及细胞活性，并使得造血干细胞能够处于增殖不分化的状态，进而达到临床移植需求，解决了现有技术中造血干细胞扩增率低、活性差且易分化等缺陷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及生物工程和生物医药领域，特别设及一种造血干细胞的体外扩增培养 方法。
技术介绍
目前造血干细胞通常有S个来源：骨髓、外周血及厮带血。与骨髓和外周血造血 干细胞相比，厮带血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，且厮带血具有富含更早期的 造血干细胞、采集方便，造血干细胞免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、移植过程中 不需要严格配型、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及 副作用、CD34+CD38-与CD34+CD33-的比例较高等优点，因而厮带血造血干细胞具有极大的 临床应用价值。但是，单份厮血的造血干细胞含量低，在临床中很难用于正常体重成人患者 的移植。因此，造血干细胞在移植前需要进行体外扩增。 目前，造血干细胞的扩增培养常采用加入血清和多种细胞因子的液体培养基、与 基质细胞共同培养或在生物反应器中培养等方法，但上述方法仍不能获得充足的具有植活 能力的造血干细胞用于临床治疗，且造血干细胞很快便发生分化、衰竭。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术中采用多种细胞因子培养造血干细 胞的方式存在造血干细胞扩增率低且活性较低、易分化等缺陷，提供一种能够提高造血干 细胞扩增率及细胞活性并保持其干细胞特性的造血干细胞的体外扩增方法。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种造血干细胞的体外扩增培 养方法，所述培养方法包括W下步骤： 获取造血干细胞； 采用小分子化合物对造血干细胞进行体外扩增培养； 其中，所述小分子化合物包括小分子抑制剂和小分子抗氧化剂。 在本专利技术提供的中，所述小分子抑制剂为MEK1/2 抑制剂或MAPKK抑制剂。 在本专利技术提供的中，所述小分子抑制剂为 PD184352 或U0126。 在本专利技术提供的中，所述小分子抗氧化剂为维生 素C、海藻糖和透明质酸中的一种。 在本专利技术提供的中，所述造血干细胞的获取过程 包括W下步骤： 采集厮血，与PBS混匀稀释后，沉降红细胞，吸出上清液；并对所述上清液离屯、后 弃上清，重悬细胞后，加入人淋己细胞分离液，静置，离屯、，收集下层的单个核细胞。 在本专利技术提供的中，沉降红细胞的过程步骤为： 将稀释后的厮血与甲基纤维素按（2~4) :1的比例混匀，室溫下静置30~45分钟。 在本专利技术提供的中，所述甲基纤维素的质量分数 为0.1%~1.0%。 在本专利技术提供的中，所述造血干细胞的获取过程 还包括W下步骤：调整所述单个核细胞密度为（0. 5~3)XIO8个/ml，加入CD34抗体，混匀，室溫解 育，加入抗人CD34磁珠混匀，解育，用含有FBS和邸TA的PBS洗涂后置于磁场中，静置后倒 掉上清液，即收获造血干细胞CD34+细胞。 在本专利技术提供的中，采用所述小分子化合物对 造血干细胞进行体外扩增培养的过程步骤为：调整所述造血干细胞CD34+细胞的密度为 (0. 5~3)XIO5个/ml，然后将造血干细胞CD34 +细胞接种于培养基中，并添加（100~200) ng/ml的小分子抗氧化剂和2JiM~4JiM的小分子抑制剂进行扩增培养。 在本专利技术提供的中，所述体外扩增培养时间为 4~8天。 实施本专利技术提供的造血干细胞体外扩增培养方法，可W达到W下有益效果：采用 小分子抑制剂和小分子抗氧化剂共同进行造血干细胞的体外扩增培养，使得造血干细胞能 够一直处于增殖不分化状态，并能够避免造血干细胞在增殖过程中分泌大量氧化产物促使 细胞调亡的问题，通过加入小分子抗氧化剂能够很好的保持细胞的活性，对造血干细胞起 到保护的作用，从而不仅提高了造血干细胞的扩增率，而且也提高了造血干细胞的细胞活 性，并使造血干细胞能够保持其干细胞特性。【具体实施方式】 为解决现有技术中采用多种细胞因子共同作用进行造血干细胞的体外扩增培养 方式存在造血干细胞扩增率低，细胞活性差且易分化等缺陷，本专利技术的创新点在于采用小 分子化合物培养造血干细胞，通过小分子抑制剂使得造血干细胞能够一直处于增殖不分化 的状态；而小分子抗氧化剂，也可消除造血干细胞在增殖过程中产生的自由基，对细胞起到 保护作用，使得造血干细胞在增殖的同时也能够保持其细胞活性，有利于提高造血干细胞 的扩增率及细胞活性，并使得造血干细胞能够处于增殖不分化的状态，进而达到临床移植 需求，解决了现有技术中造血干细胞扩增率低、活性差且易分化等缺陷。 具体地，本专利技术提供的一种，包括W下步骤： Sl、获取造血干细胞； S2、采用小分子化合物对造血干细胞进行体外扩增培养； 阳02引其中，小分子化合物是指相对分子质量小于10000的化合物補较于细胞因子，小 分子化合物的性质更为稳定，给药较为方便，其作用效果能够通过调节化合物的结构和浓 度来改变；由于小分子化合物调节作用单一，不易引发免疫反应，因此，易于在生理功能恢 复后撤出，对病理和生理过程的调节主动方便，有助于维持正常的机体生理功能，对后期造 血干细胞的移植具有重要的意义。 本专利技术中的小分子化合物包括小分子抑制剂和小分子抗氧化剂，由于造血干细胞 在增殖过程中会分泌大量氧化产物，氧化产物的自由基会使造血干细胞调亡，因此，通过加 入小分子抗氧化剂来消除自由基，从而能够很好地保持造血干细胞的活性；除此之外，抗氧 化剂也使得造血干细胞在增殖的过程始终处于低氧环境中，W模拟造血干细胞在人体内的 低氧生存环境，从而更有利于造血干细胞的增殖；而小分子抑制剂则能够使造血干细胞一 直处于增殖不分化的状态。优选地，本专利技术中所采用的小分子抗氧化剂为维生素C、海藻 糖和透明质酸中的一种；小分子抑制剂为MEK1/2抑制剂或MAPKK抑制剂，如PD184352或 U0126 等。PD184352 可购于Sigma公司，其分子式：C17H14CIF2IN2O2,分子量：478.66,是一 种ATP非竞争性的MEK1/2抑制剂，能够抑制邸K憐酸化，抑制造血干细胞的分化信号通路。 U0126 可贝勾于Sigma公司，良P1, 4-Diamino-2, 3-dicyano-l, 4-bis(o-aminophenylmercap to)butadiene,分子量为 380. 50,分子式为CisHieNeSz，是一种MAP邸抑制剂，即MAPKkinase 抑制剂或MEK1/2抑制剂。U0126可W通透细胞，选择性抑制MEK1/2信号通路，从而抑制MAP kinase巧rkl/2即P44/42MAPK)的憐酸化和激活，同时可W抑制AP-I依赖的基因转录激活， 从而能够抑制造血干细胞的分化。 进一步地，在步骤Sl中，造血干细胞可来源于骨髓、外周血及厮带血，与骨髓和外 周血造血干细胞相比，厮带血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，采集方便，免疫原 性弱、对异源性抗原产生的抗体少、移植过程中不需要严格配型、成熟性T细胞较少、采集 和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34+CD38-与CD34+CD33-的比例 较高等优点；因此，在本专利技术中，优先采用厮带血造血干细胞，具体地，造血干细胞的来源过 程为： 阳0測 Sl1、采集厮带血； S12、分离获取厮带血单个核细胞； S13、从单个核细胞中分选出造血干细胞CD34+细胞。 在步骤Sl1中，厮带血均来自健康产妇足月分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种造血干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于：所述培养方法包括以下步骤：获取造血干细胞；采用小分子化合物对造血干细胞进行体外扩增培养；其中，所述小分子化合物包括小分子抑制剂和小分子抗氧化剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44