本发明专利技术公开了一种沉默水稻过氧化氢酶基因OSCAT1的sgRNA，其序列如序列表SEQ NO.1所示。本发明专利技术首先获得OSCAT1序列设计sgRNA识别区的DNA靶标序列，然后设计OSCAT1的sgRNA表达序列并构建载体。将该载体通过农杆菌转化水稻，获得的阳性转基因苗OsCAT1的靶标序列出现错配。转基因水稻植株呈现生长矮小、不分蘖、叶片呈病叶状。利用本发明专利技术制备的水稻OSCAT1sgRNA能高效、快速、精确靶向水稻目标基因，在基础研究和生产实践上具有一定的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种抑制OSCATl基因表达的SgRNA及应用，属于基因工程
技术介绍
过氧化氨酶（Catalase,CAT)是一种四聚体血红素酶，也是第一个被发现的抗氧 化酶，在植物体中主要存在于叶绿体、线粒体、内质网中。按照催化中屯、结构差异可分为两 类：（1)含铁化嘟结构CAT,又称铁化嘟酶（FeCAT) ; (2)含儘化嘟结构CAT,即儘离子代替铁 离子，又称儘过氧化氨酶（MnCAT)。CAT的主要功能是催化&〇2分解为H2〇与〇2,减少&〇2 与化在铁馨合物作用下反应生成对植物有害的'0H。 随着研究的不断深入，过氧化氨酶在植物防御、胁迫应答W及控制细胞的氧化还 原平衡等方面起着重要的作用越来越受到人们的关注，其抗低溫、干旱、病毒W及除草剂的 功能已经在转基因植物中得到验证。DatjF等的研究发现在CAT基因缺失的烟草中，&〇2含 量升高，并产生类似于调亡的细胞死亡。Talarczyk等人在烟草中过量表达酵母OsCATl, 经检测发现转基因植株抗病毒侵染能力提高，产生的坏死斑比未转基因植物小。Miyagawa 等的研究发现在烟草中过量表达大肠杆菌巧scherichiacoli)过氧化氨酶基因后，其植株 叶绿体内的过氧化氨酶表达增强了对光、干旱和除草剂等诱导的氧化胁迫的抗性。李思义 将小麦的过氧化氨酶导入水稻中，获得过氧化氨酶高效表达的转基因水稻。运些转基因水 稻的过氧化氨酶活性增强，从而提高了对低溫伤害的耐性。Polidoros等将玉米CAT2基因 转入烟草，经检测发现转基因植株对除草剂引起的伤害抗性增强，说明过氧化氨酶也能提 高植物对除草剂的抗性。CRISPR/tas9是一种来源于原核生物的新型核酸酶系统，它由导向序列SgRNA和 核酸酶化s9两种元件组成。SgRNA可识别基因组中特定核甘酸序列并对其进行切割造成双 链DNA断裂值OUble-Strandbreaks,DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连 接（Non-homologousendjoining，畑EJ),造成移码突变（frameshiftmutation),导致基 因沉默。运一技术由于能快速、简便、高效地祀向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注， [000引精确祀向目标基因是CRISPR-化s9能否特异性沉默目标基因的先决条件，无论是 脱祀还是错误祀向，都会影响CRISPR-化s9对目标基因的特异性沉默。因此，能够设计、审U 备出精确性和特异性祀向目标基因的SgRNA成为CRISPR-化s9基因沉默的关键技术。水稻（化yzasativaL.)是最主要的粮食作物之一，全世界超过一半的人口都W 水稻作为主粮。水稻不仅是一种重要的粮食作物，也是一种重要的模式生物，对相关基因进 行功能研究具有重要作用。随着全球气候持续变暖、上壤持续恶化，逆境胁迫越来越成为制 约水稻生长发育、影响水稻产量和质量的关键因素，如干旱、高溫、高盐碱、病虫害等。挖掘 与水稻抗逆境和胁迫相关基因具有一定的理论和实践意义。CAT基因在植物的胁迫反应中 发挥着越来越重要的作用，但其在水稻中的相关功能及作用机制还知之甚少，通过在水稻 体内降低其基因的表达水平为将为其抗逆机制提供重要的理论依据和新思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抑制水稻过氧化氨酶基因OSCATl的方法，提供了一种 沉默水稻过氧化氨酶基因OSCATl的SgRNA,及用于沉默水稻OSCATl基因的载体。 本专利技术的沉默水稻过氧化氨酶基因OSCATl的SgRNA,其DNA序列如SEQIDN0.1所 /J、-O 用于沉默水稻OSCATl基因的载体，其特征在于含有特异性祀向OSCATl基因第二 外显子的SgRNA的表达载体和化s9蛋白的体外转录载体，其中SgRNA序列上游为水稻U6 启动子，化s9上游为玉米加强型启动子，筛选标记为潮霉素。 本专利技术的祀向沉默水稻过氧化氨酶基因OSCATl的载体构建方法，按W下步骤进 行： (1)根据在线软件ht1:p://c;risp;r.mit.edu/ 捜寻OSCATl(X0C_0s03g03910)基因 的合适的祀标序列，OSCATl的序列特征见SEQNO6所示，祀标序列见SEQIDNO. 2所示。 [001引 似将祀标序列去除末端NGG获得SgRNA序列，其DNA序列见SEQIDNO. 1所示；将 SEQIDNO. 1序列反向互补获得SgRNA的反向互补序列，其DNA序列见SEQIDNO. 3所示。 [001引 做在sGRNA序列的5端引入6个额外的碱基TGTGTG获得SEQIDNO. 4序列；在 sGRNA反向互补序列的5端引入4个额外的碱基AAAC，3端引入2个额外的碱基CA获得SEQ IDNO. 5序列。人工合成沈QIDNO. 4和沈QIDNO. 5的序列后并将其制备成Oligo二聚 体； (4)将制备好的Oligo二聚体连接至载体BGK03U6启动子上游，然后转化大肠杆菌 D册a获得载体BGK03-0SCAT1。 3.本专利技术的有益效果是干扰载体BGK03-0SCAT1转化水稻后，即可实现高效、快 速、特异对水稻OSCATl基因进行沉默。转基因水稻植株呈现生长矮小、不分葉、叶片呈病叶 状，可直接用此做研究材料来探讨OSCATl基因的功能和作用机理，为在生产实践上更好利 用OSCATl基因进行遗传改良奠定基础。【附图说明】 (1)图1为本专利技术的水稻OSCATl基因的目标祀位点，通过在线设计筛选第2外显 子2处为目标祀位点。小写字母代表内含子，大写字母代表外显子。 (2)图2为本专利技术的转基因水稻中OSCATl基因目标祀序列的比对结果。A为野生 型水稻9522,B-D为转基因水稻，阴影部分为目标祀序列。[001引 （3)图3为本专利技术的转基因水稻中OSCATl基因突标祀序列的峰图。A为野生型水 稻9522,B-D为转基因水稻，框内所示序列为目标祀序列，其中转基因C的祀序列全部缺失。 (4)图4为转基因水稻植株；其中A和D为野生型，B，C和E为转基因水稻。【具体实施方式】 下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，运些实施例仅用于举例说明 本专利技术，而不对本专利技术的范围构成任何限制。 实施例中所设及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、化q DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司（大连）产品，质 粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，CRISPR-化s9载体BGK03购自杭 州百格生物技术公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学W及基因工程实验 室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本专利技术实施例 中所用方法如无特别说明均为常规方法。 实施例1 :水稻OsCATl基因目标祀序列的获得 利用tigr在线数据库查找水稻OsCATl基因L0C_0s03g03910并下载。根据在线 软件ht化V/crispr.mit.e化/捜寻5' (N)20NGG-3'序列，并根据祀向位点，错配碱基数、错 配位置等进行优化，最后选择位于第二外显子上 "CTCGTTCAACGGCCCGCTGTGG"作为目标祀序列，见图 1.实本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种沉默水稻过氧化氢酶基因OSCAT1的sgRNA，其特征在于：DNA序列如SEQ IDNO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡丽芳，贺浩华，刘世强，朱昌兰，彭小松，贺晓鹏，傅军如，陈小荣，欧阳林娟，边建民，孙晓棠，徐杰，周大虎，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西;36
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