造血干细胞低氧培养方法技术

本发明专利技术涉及一种造血干细胞低氧培养方法，包括以下步骤：获取造血干细胞于培养基中进行体外培养；所述体外培养过程是在氧气体积百分比为0.5％～6％的细胞培养容器中进行的。通过为造血干细胞创造一个低氧的生长环境，以模拟造血干细胞在体内干细胞龛内的生长环境，并配合无血浆干细胞培养基培养造血干细胞，从而更有利于造血干细胞维持其活性，促进造血干细胞的生长和增殖，并提高造血干细胞的扩增率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及细胞工程
，特别设及一种。
技术介绍
造血干细胞化ematopoieticstemcells,HSCs)具有自我更新和多向分化的潜 能，在临床治疗中具有广泛应用。HSCs主要存在于骨髓中，骨髓中高度特异的造血微环境结 构-干细胞食（stemcellniche)是骨髓正常造血的特定场所，并且干细胞食内的氧浓度 非常低，目前，HSCs的体外扩增培养，通常是在高氧环境下进行的，将HSCs暴露在高氧浓度 中，反应性氧自由基会堆积在线粒体内导致细胞的氧化损伤，对细胞的扩增潜能产生不利 影响，从而无法高效地对服Cs进行体外扩增，运在一定程度上限制了服Cs的临床应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术中体外高氧环境下培养造血干细胞 存在细胞易氧化损伤，扩增潜能受限等缺陷，提供一种能够模拟体内干细胞食内的低氧环 境从而提高扩增率的。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种造血干细胞低氧培养方 法，包括W下步骤： 获取造血干细胞于培养基中进行体外培养； 所述体外培养过程是在氧气体积百分比为0. 5%~6%的环境中进行的。 在本专利技术提供的中，所述细胞培养容器中的氧气体积百 分比为1%。 在本专利技术提供的中，获取造血干细胞的过程包括W下步 骤：为采血人皮下注射5-15yg/kg粒细胞集落刺激因子，直到所述采血人每毫升外周血的 造血干细胞CD34+细胞数大于20X103后，采集所述采血人的血浆，去除血小板，收集外周血 单个核细胞。 在本专利技术提供的中，获取造血干细胞的过程还包括W下 步骤：取化5-2)X109个所述外周血单个核细胞于无菌离屯、管中离屯、，第一次重悬细胞，过 滤后离屯、，第二次重悬细胞，加入抗人CD34磁珠解育，反复重悬并离屯、细胞，过滤，置于免 疫磁珠纯化柱系统中纯化后获得造血干细胞CD34+细胞。 在本专利技术提供的中，所述造血干细胞CD34+细胞的纯度 大于95%。 在本专利技术提供的中，获取造血干细胞过程中，重悬细胞 义用的是含有人血清白蛋白的DPBS缓冲液。 在本专利技术提供的中，在第二次重悬细胞之后，加入抗人 CD34磁珠之前，还包括加入阻断剂的步骤。 在本专利技术提供的中，将获得的造血干细胞CD34+细胞置 于氧气体积百分比为0. 5%~6% -的环境中进行培养的步骤包括w下步骤： 将造血干细胞CD34+细胞置于无血浆干细胞培养基中，调整细胞的终浓度为 (1-10)X104个/mL;再置于氧气体积百分比为0. 5%~6%的环境中培养。 在本专利技术提供的中，所述无血浆干细胞培养基 中添加有0. 005-0. 020yg/ml的白细胞介素-3、0. 005-0. 020yg/ml的白细胞介 素-6、0. 005-0. 020yg/ml的干细胞因子、0. 015-0. 030yg/ml的血小板生成素和 0. 015-0. 030yg/ml的人FMS样酪氨酸激酶3配体。 在本专利技术提供的中，在氧气体积百分比为0.5%~ 6%-的环境中培养6-8天。 实施本专利技术提供的，可W达到W下有益效果：通过为造 血干细胞创造一个低氧的生长环境，W模拟造血干细胞在体内干细胞食内的生长环境，并 配合无血浆干细胞培养基培养造血干细胞，从而更有利于造血干细胞维持其活性，促进造 血干细胞的生长和增殖，并提高造血干细胞的扩增率。【附图说明】[001引下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中： 图1为本专利技术提供的中所采用的细胞培养容器的结构 示意图。【具体实施方式】 为解决现有技术中体外正常氧含量环境下培养造血干细胞存在细胞易损伤、扩增 率低等缺陷，本专利技术的创新点在于提供一种造血干细胞的低氧培养方法，通过将造血干细 胞置于低氧环境中进行体外培养，即氧气体积百分比为0. 5~6%环境中，W模拟适宜造血 干细胞生长的干细胞食内的低氧环境，更有利于造血干细胞的生长和增殖，从而实现了提 高造血干细胞扩增率的目的。 本专利技术提供的，包括W下步骤： 先获取造血干细胞，W进行低氧环境中体外培养，具体的操作方法是先从人的外 周血中获取到外周血单个核细胞，再纯化得到造血干细胞CD34+细胞，从而将造血干细胞 CD34+细胞置于低氧环境中进行体外培养；其中，低氧环境中的氧气体积百分比为0. 5~ 6%。 本专利技术提供的具体的实施方式是： 造血干细胞可来源于外周血、厮带血W及骨髓等，由于外周血的来源较广，且采集 较为方便，因此，本专利技术优选采用从人的外周血中获取造血干细胞。另外，为进一步提高造 血干细胞的纯度，本专利技术优选采用免疫磁珠纯化柱系统分离纯化出外周血中的造血干细 胞。进一步地，获取造血干细胞的步骤为：S11、采集外周血单个核细胞；S12、对步骤S11中获取的外周血单个核细胞进行反复离屯、重悬后，加入免疫磁珠 纯化柱系统中进行分离纯化； 步骤SI1具体为：每日给予采血人皮下注射5-15yg/kg的G-CSF(粒细胞集落刺 激因子），W促进造血干细胞的增殖、分化和活化，并促进造血干细胞向血液中扩散，优选 地，G-CSF的浓度为10yg/kg;直到采血人每毫升外周血的CD34+细胞数大于20X103个后， 使用血细胞分离机（购于美国Baxter,Dee计ield,IL公司，型号为化nwalCS3000)采集人 的血浆300ml，收集速度85ml/min，之后用血细胞分离机去除血小板，得到外周血单个核细 胞，即造血干细胞单个核细胞。 步骤S12全程均为无菌操作，具体步骤为：S121、收集步骤S11中获取的化5-2)X109个外周血单个核细胞放入50ml无菌 离屯、管中；S122、W600g的离屯、加速度在4°C下离屯、细胞5min，完全弃去上清液；[003引 S123、按300iil/108细胞的比例，用含5%人血清白蛋白的DPBS缓冲液（购于 Sigma公司）重新悬浮细胞，即300y1的DPBS缓冲液中加入108个细胞；S124、过滤除去细胞悬液中的小凝块；本专利技术中优选采用孔径为40nm的细胞尼龙 滤网（购于美国抓Biosciences公司）进行过滤；S125、在4°CW600g的离屯、加速度离屯、细胞5分钟，弃去上清液；S126、按300y1/108个细胞的比例，再次用含5%人血清白蛋白的DPBS缓冲液重 新悬浮细胞，即300y1的DPBS缓冲液中加入1〇8个细胞；S127、按100y1/1〇8细胞的比例加入FcR阻断剂（购于加拿大Milten}dBiotec 公司）（即100y1的FcR阻断剂中加入l〇s个细胞），W阻断造血干细胞CD34 +细胞的非 特异性结合，从而避免影响造血干细胞CD34+细胞与磁珠上的抗体结合，W提高造血干细胞 CD34+细胞的分离纯化度；S128、按100y1/108细胞的比例加入抗人CD34微磁珠，充分混匀后在4°C冰箱 解育30分钟；即在100y1的抗人CD34当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种造血干细胞低氧培养方法，其特征在于，包括以下步骤：获取造血干细胞于培养基中进行体外培养；所述体外培养过程是在氧气体积百分比为0.5％～6％的环境中进行的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44