用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法，包括：获取诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞；将诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞于O2体积分数1～5％条件下共培养。采用本发明专利技术的上述方法，采用小鼠骨髓基质细胞构建造血细胞微环境，将其与诱导性多能干细胞共培养，通过共培养使细胞代谢中产生细胞信号蛋白、细胞因子等，从而实现将诱导性多能干细胞诱导分化成造血干细胞；并且控制诱导的过程在低氧条件进行，可以加强细胞的自分泌能力，分泌物的量增加以后可以使上述诱导效果进一步加强，更利于细胞的分化，具有更高的细胞转化率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于造血干细胞制备
，具体涉及一种用诱导性多能干细胞诱导制 备造血干细胞的方法。
技术介绍
血液肿瘤治疗中，最常用的方法是放疗/化疗，通过放/化疗可杀死肿瘤细胞或异 常克隆细胞，终止其无限增殖；同时，在治疗中加大放/化疗剂量，可最大限度杀灭肿瘤细 胞，增加肿瘤杀灭的效果；但增大放/化疗剂量的同时也会加重对造血功能、免疫功能的损 伤。所以血液肿瘤化疗/放疗之后，一般都需要对引起的造血功能损伤进行修复和治疗。造 血功能损伤分为造血细胞损伤和造血微环境损伤，后者损伤严重程度远远大于前者，且更 加持久甚至不可逆转，这是影响患者继续接受后续治疗的主要因素。 造血细胞和造血微环境的损伤修复比较好的方法细胞移植，将正常功能的造血干 细胞（或者是祖细胞，祖细胞属于成体干细胞，是一种未分化的多能或专能干细胞）移植至 损伤部位，自行生长分化从而对损伤部位进行补充和修复。但是制备所需要的造血干细胞， 多采用iPS细胞（inducedpluripotentstemcell，诱导性多能干细胞，其具有多能干细胞 的特性，并具有多种分化潜能）进行体外诱导制备。采用iPS细胞在体外分化制备的造血 干细胞，是自身体细胞重编程而来的，不存在异体免疫排斥的问题。 现有以iPS细胞分化为造血干/祖细胞的方法是细胞因子单层诱导，即以iPS细 胞在体外培养中用造血干细胞的细胞因子诱导其分化。但是这一方法在实施中，诱导过程 不是在人体内调控和特定环境下进行，有一部分细胞的分化方向并不是完全造血干细胞进 行，也有一些细胞虽然分化具有造血干细胞的性质、但是还会同时带有一些其他的性状，同 时还有一部分细胞分化程度低或者是不分化，达不到造血干细胞的程度；所以这一方法制 备造血干细胞的诱导率不高，能得到较为适合的造血干细胞的数量比较少；而且要进行大 量培养，细胞因子在现阶段在诱导物中是属于价格最昂贵的，所以在产效收益上该方法无 法满足规模实施的可行性。
技术实现思路
本专利技术实施的目的在于克服现有造血干细胞大量制备的缺陷，提供一种用诱导性 多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下： -种，包括如下步骤： 获取诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞； 将所述诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞于02体积分数1~5%条件下共培 养。 采用本专利技术的上述方法，采用小鼠骨髓基质细胞构建造血细胞的模拟骨髓微环 境，将其与诱导性多能干细胞共培养，通过共培养使细胞代谢中产生细胞信号蛋白、细胞因 子等，从而实现对诱导性多能干细胞诱导分化成造血干细胞；并且控制诱导的过程在低氧 条件进行，可以加强细胞的自分泌能力，分泌物的量增加以后可以使上述诱导效果进一步 加强，更利于诱导性多能干细胞的分化，具有更高的细胞转化率。【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于 限定本专利技术。 本专利技术实例提出一种，方法步骤 包括：S10,获取诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞；S20,将步骤S10获取的诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞于含02量1~5% (体积分数）环境下共培养。 本专利技术的上述造血干细胞的制备方法，采用小鼠骨髓基质细胞构建诱导性多能干 细胞的诱导基质。骨髓基质细胞是骨髓中的一类多能干细胞，在骨髓组织中对骨髓血系细 胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为"骨髓基质细胞。而根据对骨髓内 环境的分析和研究，骨髓基质的重要功能是造血系统提供的微环境，对造血系统起支持作 用。骨髓基质的重要细胞组成就是骨髓基质细胞，而小鼠骨髓基质细胞源于小鼠骨髓基质， 其表面表达envgp70抗原，在形态学、表型及功能上有吞噬细胞的特征，更容易对其他细胞 产生相互作用，利于诱导。所以本案中的采用小鼠骨髓基质细胞构建造血细胞微环境，将其 与诱导性多能干细胞共培养，通过共培养使细胞代谢中产生细胞信号蛋白、细胞因子等，从 而实现对诱导性多能干细胞实现诱导。 同时，共培养的过程在含02量1~5%(体积分数）环境下进行，相比通常培养的 空气氛围（空气中含〇2量21% )，低氧环境培养更加会接近于体内代谢的情况；在多种研究 和报道中，正常生理状态下人体内的氧浓度一般是2%~9%，骨髓质和骨髓中的氧浓度更 低一些，基本上只有1%左右，所以本案中采用含02量1~5%的低氧环境进行诱导培养， 一方面是为了使细胞的诱导环境能更加贴合于体内造血干细胞生成环境。而且在反复实施 后，低氧条件下小鼠骨髓基质细胞培养过程中其生产出的细胞因子的量有明显的提升，研 究发现低氧环境下，原因可能是在低氧的条件下，细胞自分泌的功能自身会增强，导致在聚 集培养过程中细胞因子的浓度得到提高，而有利于细胞表型的维持，是自身更加适于低氧 下的生长和繁殖。 因此采用本案的上述方式进行共培养，以小鼠骨髓基质细胞诱导种子细胞诱导性 多能干细胞向造血干细胞分化，其构建的诱导环境是模拟的细胞骨髓微环境，而不是单纯 的细胞因子化学环境，通过细胞间的通信和相互作用，更加利于分化表型的形成；同时，在 共培养的过程中，在对诱导性多能干细胞的诱导分化的过程中，分化的过程起重要作用可 能不是细胞因子，而是一些胞间物质，所以本案的共培养中小鼠骨髓基质细胞分析的很多 细胞因子之外的代谢物质能对现有的细胞因子诱导的不足进行弥补；并且在低氧环境下进 行诱导，通过加强细胞的自分泌能力，分泌物的量增加以后可以使上述诱导效果进一步加 强，更利于诱导性多能干细胞的分化。 在本专利技术的上述实施方式中，细胞生长和诱导的过程中，培养中由于采用的是低 氧诱导，可能会影响细胞的呼吸过程，不能完全的进行有氧代谢；代谢的过程中培养液中的 乳酸含量相比通常培养的方式中增加的更快，较大浓度的乳酸一方面会酸化培养环境，同 时还会抑制细胞的生长；因此相比通常的培养，本案中需要进一步加快换液，以避免乳酸大 量积累。基本上实施中按照20~30h/次进行即可。 同时，在本案的共培养中采用mTeSRr培养基，mTeSRr培养基是商品化的无饲养层 培养基，也是一种不含血清的完全细胞培养基，可以直接购买获得。其不含有细胞因子的成 分，一方面相比其他含有细胞生长因子的培养基可以避免导致出现非造血干细胞的诱导； 另一方面在于其中含有一些蛋白成分可以对细胞的胞间蛋白进行补充，加强诱导过程中的 细胞通信。 进一步在细胞共培养的过程中，小鼠骨髓基质细胞自身的代谢和自分泌是形成诱 导环境的主体，步骤S20在实施的过程中按照，诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞的 数量比为1:3~6进行共培养。在实施中，小鼠骨髓基质细胞较少时，诱导的效力非常低， 直接持续到培养至l〇d左右时，其诱导分化声称的造血干细胞的量不多；而如果进一步增 加小鼠骨髓基质细胞的数量至比较多的，共培养体系中诱导性多能干细胞自身的生长和分 化处于竞争性劣势，反倒小鼠骨髓基质细胞自身快速大量扩增，造成诱导性多能干细胞的 生长分化受到抑制；因此在反复实施对比之后，本案优选采用上述比例范围下进行实施。 同时上述步骤S20实施至基本上诱导分化生成造血干细胞的程度基本稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：获取诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞；将所述诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞于O2体积分数为1～5％条件下共培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44