猪流行性腹泻病毒株和由其产生的免疫原性组合物制造技术

本发明专利技术涉及猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus；“PEDV”)的新型核苷酸和氨基酸序列，包括其新型基因型，其皆适用于制备用以治疗和预防猪和其它动物中的疾病的疫苗。根据本发明专利技术的实践提供的疫苗可有效针对多种猪PEDV基因型和分离物。诊断性和治疗性多克隆和单克隆抗体也是本发明专利技术的特征，如适用于传播病毒和制备疫苗的感染性纯系。本发明专利技术的尤其重要方面包括在组织培养物和宿主猪中复制的聚核苷酸构筑体。本发明专利技术还提供可在宿主动物和组织培养物中有效复制的新型全长PEDV基因组。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】猪流行性腹泻病毒株和由其产生的免疫原性组合物相关申请的交叉引用本申请案要求2015年2月27日申请的临时专利申请案第62/121,955号、2015年8月24日申请的临时专利申请案第62/209,119号、2015年11月4日申请的临时专利申请案第62/250,961号以及2016年1月7日申请的临时专利申请案第62/276,022号在35U.S.C§119下的优先权，其以全文引用的方式并入本文中。
本专利技术涉及新型免疫原性组合物，其保护猪免患由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的疾病。
技术介绍
猪流行性腹泻(PED)在猪，尤其幼小猪崽中具有高传染性并且其特征在于脱水、腹泻以及高死亡率。病原体，猪流行性腹泻病毒(PEDV)是单股、阳性有义RNA病毒，其属于冠状病毒科(Coronaviridae)中的甲型冠状病毒(Alphacoronavirus)属。PEDV的总基因体尺寸是约28kb并且含有7个开放阅读框架。PEDV感染的症状通常与由传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪δ冠状病毒(porcinedeltacoronavirus；PDCoV)引起的症状类似，这两种病毒也是冠状病毒科的成员。应注意，通常并不观察到PEDV与TGEV之间的交叉保护，整体病毒核苷酸序列最多约60％相似。PED可能在约1970年在欧洲首先观察到，并且随后表征致病病毒(参见例如M.Pensaert等人,《病毒学文献(Arch.Virol)》,第58卷,第243-247页,1978和D.Chasey等人,《兽医科学研究(Res.VetSci)》,第25卷,第255-256页,1978)。PEDV直到2013年才在北美发现，在那时开始广泛爆发，并且对猪产业造成严重的经济损失。病毒在数天内在多个广泛分布的母猪群中出现，并且其传播到至少32个州。生产商可预计在未经处理的新生猪崽中的损失高达100％。当前用于管理感染的建议包括实施严格的生物安全措施和/或故意使整个畜群暴露于PEDV以实现免疫性。PEDV在1970年代和1980年代期间在若干个欧洲国家引起分布广泛的流行；但从1990年代起，PED在欧洲变得罕见，仅偶尔爆发。接着，这种经典的PEDV菌株传播到亚洲国家，如日本、中国、韩国等。从2010年起，已经在中国报道严重的PED流行性爆发，并且从这些爆发回收的PEDV在遗传学上与经典的PEDV菌株不同。美国猪类中的最初PED爆发与在中国观察到的爆发具有类似的临床表现。序列分析表明原始美国PEDV(下文称为美国PEDV原型菌株)在遗传学上与2011-2102年在中国循环的一些PEDV最类似。在2014年1月，在美国猪群中发现PEDV变异型菌株，其与美国PEDV原型菌株相比在刺突蛋白基因中具有插入和缺失(INDEL)。这种变异型菌株称为美国PEDVS-INDEL-变异体菌株。在美国爆发PED之后，加拿大、墨西哥、台湾、韩国和日本报道检测到美国原型样PEDV；韩国、日本、德国、比利时、法国和葡萄牙已报道检测到美国S-INDEL-变异体样PEDV。当前，PEDV仍然是全球猪产业的重大威胁。PEDV通常在培养物中生长不充分，并且需要鉴别适合于培养足够用于市售疫苗制备的病毒的两种具体菌株。此外，需要研发可提供针对PEDV的已知分离物的有效交叉保护的疫苗，并且预期其可提供针对全世界范围内正在进化的PEDV菌株的有效交叉保护。
技术实现思路
本专利技术涵盖免疫原性组合物，其包含从原型菌株和插入缺失菌株传代的变异型PEDV菌株。美国PEDVS-INDEL-变异体菌株在遗传学上与美国PEDV原型样菌株不同，其在刺突蛋白S1结构域区域，具体地说，其第一个1170个碱基中包括特征插入和缺失。插入和缺失包括3个缺失(位置167处的1-nt缺失、位置176处的11-nt缺失和位置416处的3-nt缺失)、位置474与475之间的6-nt插入和主要位于S1区域的第一个1,170个核苷酸中的若干其它突变。美国PEDVS-INDEL-变异体菌株的毒性低于美国PEDV原型菌株，并且在一个实施例或完整病毒中可用作经灭毒的活疫苗。当给予猪崽时，感染本专利技术的活的、经灭毒的连续传代S-INDEL-变异体菌株的猪不引起疾病，并且重要的是，呈现针对用毒性原型PEDV菌株或S-INDEL-变异体菌株进行的攻击的交叉保护。因此，本专利技术包含适于用作疫苗的免疫原性组合物，其包含可有效引发猪中产生中和抗体的量的本专利技术的S-INDEL-变异体PEDV菌株(优选是活的并且经灭毒的)或其免疫原性片段、一种或多种佐剂和任选的一种或多种赋形剂。佐剂优选提供具有其它成分的水包油乳液。本专利技术的免疫原性组合物保护猪免受由PEDV引起的感染，并且在单次给药、两次给药程序或涉及多次给药的疫苗接种程序中有效，所述多次给药可间隔至少一周，并且任选地以更大的时间间隔进行，如一至若干个月。应注意，视具体猪群体中的传染病威胁程度而定，可作为预防措施不时地重复一次、两次或多次给药的疫苗给药程序。此外，应注意，在怀孕期间对母体猪进行接种将经由初乳和乳汁中抗体和T细胞的母体转移对幼小猪崽提供保护，但这类保护可能需要通过对猪崽进行额外的疫苗接种给药来维持。涵盖所有猪(包括猪崽和成年猪)的疫苗接种。意外发现本专利技术的美国PEDVS-INDEL-变异体菌株提供针对其它PEDV菌株的交叉反应性/保护，并且预期通常将提供针对欧洲菌株且更具体地说，针对最近在欧洲出现的在完全基因组序列级方面与美国S-INDEL-变异体菌株具有极高遗传类似性(>99％)的分离物的保护。相应地，本专利技术的接种组合物适用于保护猪免受由PEDV的欧洲菌株(通常包括现有分离物)引起的疾病或攻击。本专利技术包括PEDV的新型核苷酸和氨基酸序列，包括其新型基因型，其皆适用于制备用以治疗和预防猪和其它动物中的疾病的疫苗。根据本专利技术的实践提供的疫苗可有效针对多种猪PEDV基因型和分离物。诊断性和治疗性多克隆和单克隆抗体也是本专利技术的特征，如适用于传播病毒和制备疫苗的感染性纯系。尤其重要的是，存在所公开的疫苗，其包含作为抗原的完全病毒(活的或经灭毒的)或PEDV开放阅读框架的单一抗原蛋白质(最具体地说，来自刺突蛋白基因的第一个2.2kb，更具体地说，S1结构域)，以及编码PEDV蛋白质的全长序列的片段。本专利技术还提供细胞培养物中不同传代的PEDV菌株的全长基因组序列，其可在宿主动物和组织培养物中有效复制。本专利技术提供治疗或预防动物中由PEDV感染引起的疾病或病症(包括直接由PEDV引起的疾病病况和由PEDV促成或增强的疾病病况)的方法。猪中可由PEDV增强并且也可根据本专利技术的实践治疗或预防的疾病病况包括由传染性胃肠炎病毒、PHEV和PRCV引起或与其相关的疾病病况。本专利技术还包括给予组合疫苗(即抗原的二价或多价组合)的方案，所述组合疫苗可包括针对非PEDV病原体的活的、经修饰的活的或不活化的抗原，以及适当选择的佐剂。部分基于如本文中所公开的独特PEDV序列，本专利技术还提供用于区分用上述PEDV疫苗进行疫苗接种的猪动物与感染PEDV的野生株的猪动物的诊断试剂盒。本专利技术的代表性实施例包括经分离的聚核苷酸序列，其包括编码变异型PEDV蛋白质的基因组聚核苷酸，所述变异型PEDV蛋白质是经灭毒的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由DNA聚核苷酸编码的经分离的猪流行性腹泻病毒(PEDV)，所述DNA聚核苷酸在核苷酸层面上与SEQ ID NO:67至少95％一致并且包括以下氨基酸特征中的一个或多个：(a)多蛋白1a/1b的位置551处(紧接在DAT之后)的L或P，如通过参考SEQ ID NO:46测定，或其保守性取代；(b)刺突蛋白的位置1009处(紧接在NIT之后)的P，如通过参考SEQ ID NO:47测定，或其保守性取代；(c)刺突蛋白的位置973处(紧接在PFS之后)的H，如通过参考SEQ ID NO:47测定，或其保守性取代；以及(d)ORF3的编码序列的修饰，其引起ORF3翻译的早期终止。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.27 US 62/121,955;2015.08.24 US 62/209,119;1.一种由DNA聚核苷酸编码的经分离的猪流行性腹泻病毒(PEDV)，所述DNA聚核苷酸在核苷酸层面上与SEQIDNO:67至少95％一致并且包括以下氨基酸特征中的一个或多个：(a)多蛋白1a/1b的位置551处(紧接在DAT之后)的L或P，如通过参考SEQIDNO:46测定，或其保守性取代；(b)刺突蛋白的位置1009处(紧接在NIT之后)的P，如通过参考SEQIDNO:47测定，或其保守性取代；(c)刺突蛋白的位置973处(紧接在PFS之后)的H，如通过参考SEQIDNO:47测定，或其保守性取代；以及(d)ORF3的编码序列的修饰，其引起ORF3翻译的早期终止。2.根据权利要求1所述的病毒，其由具有SEQIDNO:35、36或37中所阐述的序列的聚核苷酸编码。3.根据权利要求1所述的病毒，其中编码所述病毒的所述DNA聚核苷酸在全长核苷酸层面上与SEQIDNO:67至少98％一致。4.根据权利要求1所述的病毒，其中编码所述病毒的所述DNA聚核苷酸在全长核苷酸层面上与SEQIDNO:67至少99％一致。5.根据权利要求1所述的病毒，其中编码所述病毒的所述DNA聚核苷酸在全长核苷酸层面上与SEQIDNO:67至少99.5％一致。6.根据权利要求1所述的病毒，其中所述ORF3的修饰包含缺失，其产生位置138-143处(紧接在SEQIDNO:48中的NGKAA之后)的氨基酸LTANPL和位置143之后的所述ORF蛋白质的截短。7.根据权利要求1所述的病毒，其中所述指定氨基酸中的一个或多个的保守性取代是选自：(1)缬氨酸或异白氨酸取代白氨酸；(2)甘氨酸取代脯氨酸；以及(3)赖氨酸或精氨酸取代组氨酸。8.一种疫苗组合物，其包含根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒(PEDV)和载剂，其中所述组合物能够保护猪避免PEDV的变异体和原型菌株的攻击以及预防或治疗与PEDV感染相关的一种或多种症状，并且其中保护的实现是通过选自以下组成的组的终点测定：预防或控制脱水、发热、腹泻、呕吐、哺乳性能不良、繁殖性能不良、死亡等PEDV感染症状中的任一种，和预防或控制体重减轻或增重失败。9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述病毒是活的或经杀灭的。10.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述载剂是稀释剂。11.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其进一步包含佐剂。12.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述受保护的猪包括大母猪、小母猪、公猪、肉猪和猪崽中的任一种。13.根据权利要求12所述的疫苗组合物，其中所述疫苗在单次给药程序中有效。14.根据权利要求12所述的疫苗组合物，其中所述疫苗在两次给药程序中有效。15.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述第一次给药是在猪崽为约1-7日龄时给予，并且第二次给药是在猪崽为2-5周龄时给予。16.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其中所述单次给药是在约1-21日龄，优选在约1-7日龄时给予。17.根据权利要求8中任一权利要求所述的疫苗组合物，其中所述最小有效剂量在约10与约106log10TCID50之间。18.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是溶解于油中的去油化卵磷脂，通常是轻液链烷烃和氢氧化铝。19.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其中所述佐剂是CpG/DEAE-聚葡萄糖/矿物油(TXO)。20.一种经分离的猪流行性腹泻病毒(PEDV)，其由在全长核苷酸层面上与SEQIDNO:37至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核苷酸序列编码，其中所述核苷酸序列包含以下中的一个：(1)ORF1a/1b蛋白质，其在其对应于SEQIDNO:46中的位置551(紧接在DAT之后)的氨基酸位置具有脯氨酸残基；和(2)刺突蛋白，其在其对应于SEQIDNO:47中的位置973(紧接在PFS之后)的氨基酸位置具有组氨酸残基。21.一种治疗或预防猪崽中由PEDV引起的疾病的方法，其包含在所述猪崽是约1-7日龄时给予所述猪崽第一剂量的根据权利要求8所述的疫苗组合物。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述给药进一步包括在所述猪崽是约2-5周龄时给予第二剂量的所述疫苗。23.根据权利要求22所述的方法，其中给予所述猪崽2次给药，并且母体猪，尽管在育种前接种，但不在生育前接种。24.根据权利要求22所述的方法，其中给予所述猪崽2次给药，并且所述母体猪在生育前接种。25.一种治疗或预防猪崽中由PEDV引起的疾病的方法，其包含在所述猪崽是约1-7日龄时给予所述猪崽单次有效剂量的根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述母体猪未经PEDV处理，并且未在任何时间接种。26.一种全长RNA聚核苷酸，其对应于根据权利要求1所述的编码DNA聚核苷酸，或其补体。27.根据权利要求27所述的RNA聚核苷酸，其是感染性纯系。28.一种质体或细菌人工染色体，其包含根据权利要求1所述的编码DNA聚核苷酸。29.一种活的经灭毒的病毒组合物，其包含：经传代的插入缺失变异体菌株猪流行性腹泻病毒(PEDV)，和载剂，其中所述经传代的插入缺失变异体菌株用以下氨基酸取代或缺失中的一个或多个编码以下蛋白质中的一个或多个或其保守性修饰变异体：如通过参考SEQIDNO:46、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV刺突蛋白的位置633处的赖氨酸(K)(紧接在KPL之后的K)、位置884处的精氨酸(R)(紧接在DPA之后的R)、位置959处的丙氨酸(A)(紧接在GGM之后的A)、位置345处的缬氨酸(V)(紧接在LSF之后)、位置48处的白氨酸(L)(紧接在AVV之后的L)、位置1225处的天冬氨酸(D)(紧接在SLV之后的D)、位置973处的组氨酸(H)(紧接在PFS之后的H)和位置1272处的酥氨酸(T)(紧接在FNA之后的T)；如通过参考SEQIDNO:48、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDVORF3蛋白质的位置189处白氨酸(L)(紧接在NPL之后的L)的缺失、138-144(紧接在KAA之后)的缺失、位置8处酪氨酸(Y)(紧接在LFO之后的Y)的缺失和位置174-189(紧接在LAI之后)的缺失；如参考SEQIDNO:51、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV核衣壳蛋白的位置27处的组氨酸(H)(紧接在VTN之后的H)；如通过参考SEQIDNO:46、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV多蛋白1a/1b的位置1591处的甲硫氨酸(M)(紧接在KVS之后的M)、位置5087处的丝氨酸(S)(紧接在FST之后的S)和位置6138处的S(紧接在TFS之后的S)；如通过参考SEQIDNO:49、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV包膜蛋白的位置62处的苯丙氨酸(F)(紧接在VYK之后的F)；以及如通过参考SEQIDNO:45、其相应同系物或其保守性取代测定的PEDV膜蛋白的位置5处的丙氨酸(紧接在SNG之后的A)和位置183处的异白氨酸(I)(紧接在YGG之后的I)。30.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的插入缺失变异体菌株编码以下具有所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：PEDV刺突蛋白(例如SEQIDNO:47)的位置633处的K(紧接在KPL之后的K)；和PEDVORF3蛋白质(SEQIDNO:48)的位置189处的L(紧接在NPL之后的L)的缺失。31.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的插入缺失变异体菌株编码以下具有所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：PEDV刺突蛋白(SEQIDNO:47)的位置633处的K(紧接在KPL之后的K)和位置884处的R(紧接在DPA之后的R)；PEDVORF3蛋白质(SEQIDNO:48)的位置189处的L(紧接在NPL之后的L)的缺失。32.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的插入缺失变异体菌株编码以下具有所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：PEDV刺突蛋白(SEQIDNO:47)的位置884处的R(紧接在DPA之后的R)和位置959处的A(紧接在GGM之后的A)；PEDVORF3蛋白质(SEQIDNO:48)的位置189处的L(紧接在NPL之后的L)的缺失。33.根据权利要求1所述的活的经灭毒的病毒组合物，其中所述经传代的插入缺失变异体菌株编码以下具有所示氨基酸取代的蛋白质或其保守性修饰变异体：PEDV刺突蛋白(SEQIDNO:47)的位置48处的L(紧接在AVV之后的L)、位置345处的V(紧接在LSF之后)、位置884处的R(紧接在DPA之后的R)以及位置959处的A(紧接在GGM之后的A)；PEDVORF3蛋白质(SEQIDNO:48)的138-144(紧接在KAA之后)的缺失和189处L(紧接在NPL之后的L)的缺失；和PEDV核衣壳蛋白(SEQIDNO:51)的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建强，陈起，P高杰，D马德森，JM哈德姆，M班德里克，JG卡尔弗特，JR汤普森，MI斯托伊娃，W瓦尔迪兹，
申请(专利权)人：衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司，硕腾服务有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US