一种羊瘁狙疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及兽医微生物学技术领域，具体涉及一种羊瘁狙疫苗的制备方法。该疫苗的制备方法包括：菌株的筛选、菌株的培养、菌株毒力验证及疫苗制备。本发明专利技术的菌株为分离自青藏高原牧区的高产毒C型产气荚膜梭菌(海C1菌株)，常规培养产毒能力可达4000MLD/ml，通过优化菌株最佳产毒条件、改进培养基配方，确定最佳产毒时间等参数，可使该C型产气荚膜梭菌(海C1菌株)产毒素的能力平均达6000～8000MLD/ml，远高于常规疫苗生产用菌株的产毒素能力400～1000MLD/mL，且通过培养条件优化，使海C1菌株的培养特性及产毒能力比较稳定，大大降低了生产成本，提高了生产效率。

A method of preparation of the vaccine of sheep sudden sniper

【技术实现步骤摘要】
一种羊瘁狙疫苗的制备方法
本专利技术涉及兽医微生物学
，具体涉及一种羊瘁狙疫苗的制备方法。
技术介绍
C型产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是引起羊瘁狙的主要病原，为革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌。该菌产生的致死毒素主要是和β毒素，该病的发病率可达40％～50％，死亡率可高达100％。由于本病发病急、死亡快、因此对于本病的防制主要用疫苗进行免疫预防。羊瘁狙疫苗免疫效果的好坏主要取决于制备疫苗菌株的产β毒素的能力，只有提高了抗原浓度，才能保证疫苗的效价及对动物的保护效果。现用羊瘁狙疫苗常规疫苗生产用菌株的产β毒素能力一般在400～1000MLD/ml。且培养困难，不易制备大量的毒素抗原。根据朱良全等在《c型产气荚膜梭菌合成培养基使用参数及培养毒素浓缩工艺优化》文献报道，所用菌株CVCC60102株的产毒力在500～1000MLD/ml；刘泽文等在《C型产气荚膜梭菌不同菌株交叉免疫保护力研究》中报道的菌株C59-2、C59-37和C59-38三株菌的产毒能力均在1000MLD/ml以下。菌株的产毒能力较低，将会出现如下几个问题的出现：(1)疫苗生产效率低下，企业生成成本提高；(2)疫苗中抗原含量降低，免疫保护力不足；(3)疫苗的免疫期缩短，需增加免疫次数，提高劳务成本；(4)抗原量过低或勉强能达到保护水平，存在潜在的免疫失败风险；(5)标准菌株与地方流行性菌株存在交叉免疫效果不良的现象，造成免疫失败。因此，筛选具有优良产毒特性的地方高产毒菌株，对于提高羊瘁狙疫苗的免疫保护效果十分有必要；另外，通过优化培养方法，提高菌株的稳定性及产毒效率，对于提高生产效率，降低成本输出具有重要的意义。
技术实现思路
基于上述陈述，本专利技术的目的在于提供一种羊瘁狙疫疫苗的制备方法。一种羊瘁狙疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：步骤1菌株的筛选：S1：菌株厌气培养，将19株分离菌株分别接种到肉肝胃酶消化汤培养基中，37℃培养12h，抹片镜检呈单一的梭状杆菌，革兰氏染色阳性(见附图1)；S2：DNA检测，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取19株菌株的DNA，利用设计的16SrRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖电泳检测可在1450bp处检测到目的条带，将扩增产物测序分析，与GENBANK中公布的C型产气荚膜梭菌的同源性在99％以上，证明菌株血清型符合C型产期荚膜梭菌属的特性；步骤2菌株的培养：将步骤1检测后的菌株接种到基础培养基中，37℃厌气培养，培养时间为2～24h，pH为7.5～8.8，收集培养液备用；步骤3菌株毒力验证：将步骤2的培养菌物在不同培养时间取样，4000r/min离心10min，上清液做递倍稀释，稀释比例为1:10，1:100，1:200，1:400，1:600，1:800及1:1000，皮下注射16～20g小白鼠，观察小白鼠死亡情况；步骤4疫苗制备：S1：杀菌、脱毒，将步骤2的收集的培养液按总体积的0.8％加入甲醛溶液，充分摇匀后，排出气体，38℃下杀菌3～5d，脱毒14～21d后，吸取培养物0.5～1.0ml接种至肉肝胃酶消化汤、普通斜面及营养肉汤中，37℃观察3～7d，无菌生长为合格，将脱毒后的培养物4000r/min离心10min，上清0.4ml静脉注射16～20g小白鼠5只，无小白鼠死亡为合格；S2：赋性剂的配制，按赋性剂配制方法配制铝胶，使培养物与铝胶的比例为5:1为宜，使每毫升菌苗中含铝胶7mg为准，充分混用后，分装待用；S3：菌苗的安检、无菌检验，随机抽取分装好的菌苗，吸取培养物0.5～1.0ml接种至肉肝胃酶消化汤、普通斜面及营养肉汤中，37℃观察3～7d，无菌生长为合格，将菌苗摇匀后皮下注射16～20g小白鼠1.0ml，小白鼠全部健活为合格。进一步的，所述菌株为分离自青藏高原牧区的高产毒C型产气荚膜梭菌(海C1菌株)。进一步的，步骤2所述的基础培养基包括质量百分比的如下组分：肉肝胃酶消化液1300ml，牛肉汤500ml，肝汤200ml，蛋白胨1.00％，示胨1.00％，磷酸氢二钠1.00％，磷酸氢二钾0.20％，酵母浸膏1.00％，环糊精1.00％，淀粉0.25％，硫酸铵0.20％，硫酸镁0.02％，硫酸锌0.01％，氯化钙0.01％。优化的，步骤2菌株的培养时间为6～8h，pH为8.6～8.8。相比于现有的同类产品，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的菌株为分离自青藏高原牧区的高产毒C型产气荚膜梭菌(海C1菌株)，常规培养产毒能力可达4000MLD/ml，通过优化菌株最佳产毒条件、改进培养基配方，确定最佳产毒时间等参数，可使该C型产气荚膜梭菌(海C1菌株)产毒素的能力平均达6000～8000MLD/ml，远高于常规疫苗生产用菌株的产毒素能力400～1000MLD/mL，且通过培养条件优化，使海C1菌株的培养特性及产毒能力比较稳定，大大降低了生产成本，提高了生产效率。附图说明图1为C型产气荚膜梭菌(海C1菌株)厌气培养镜检后结果图；具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种羊瘁狙疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：步骤1菌株的筛选：S1：菌株厌气培养，将19株分离菌株分别接种到肉肝胃酶消化汤培养基中，37℃培养12h，抹片镜检呈单一的梭状杆菌，革兰氏染色阳性(见附图1)；S2：DNA检测，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取19株菌株的DNA，利用设计的16SrRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖电泳检测可在1450bp处检测到目的条带，将扩增产物测序分析，与GENBANK中公布的C型产气荚膜梭菌的同源性在99％以上，证明菌株血清型符合C型产期荚膜梭菌属的特性；步骤2菌株的培养：将步骤1检测后的菌株接种到基础培养基中，37℃厌气培养，培养时间为2h，pH为7.5，收集培养液备用；步骤3菌株毒力验证：将步骤2的培养菌物在不同培养时间取样，4000r/min离心10min，上清液做递倍稀释，稀释比例为1:10，1:100，1:200，1:400，1:600，1:800及1:1000，皮下注射16～20g小白鼠，观察小白鼠死亡情况；步骤4疫苗制备：S1：杀菌、脱毒，将步骤2的收集的培养液按总体积的0.8％加入甲醛溶液，充分摇匀后，排出气体，38℃下杀菌3d，脱毒14d后，吸取培养物0.5ml接种至肉肝胃酶消化汤、普通斜面及营养肉汤中，37℃观察3d，无菌生长为合格，将脱毒后的培养物4000r/min离心10min，上清0.4ml静脉注射16～20g小白鼠5只，无小白鼠死亡为合格；S2：赋性剂的配制，按赋性剂配制方法配制铝胶，使培养物与铝胶的比例为5:1为宜，使每毫升菌苗中含铝胶7mg为准，充分混用后，分装待用；S3：菌苗的安检、无菌检验，随机抽取分装好的菌苗，吸取培养物1.0ml接种至肉肝胃酶消化汤、普通斜面及营养肉汤中，37℃观察5d，无菌生长为合格，将菌苗摇匀后皮下注射16～20g小白鼠1.0m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羊瘁狙疫疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1菌株的筛选：S1：菌株厌气培养，将19株分离菌株分别接种到肉肝胃酶消化汤培养基中，37℃培养12h，抹片镜检呈单一的梭状杆菌，革兰氏染色阳性；S2：DNA检测，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取19株菌株的DNA，利用设计的16S rRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖电泳检测可在1450bp处检测到目的条带，将扩增产物测序分析，与GENBANK中公布的C型产气荚膜梭菌的同源性在99％以上，证明菌株血清型符合C型产期荚膜梭菌属的特性；步骤2菌株的培养：将步骤1检测后的菌株接种到基础培养基中，37℃厌气培养，培养时间为2～24h，pH为7.5～8.8，收集培养液备用；步骤3菌株毒力验证：将步骤2的培养菌物在不同培养时间取样，4000r/min离心10min，上清液做递倍稀释，稀释比例为1:10，1:100，1:200，1:400，1:600，1:800及1:1000，皮下注射16～20g小白鼠，观察小白鼠死亡情况；步骤4疫苗制备：S1：杀菌、脱毒，将步骤2的收集的培养液按总体积的0.8％加入甲醛溶液，充分摇匀后，排出气体，38℃下杀菌3～5d，脱毒14～21d后，吸取培养物0.5～1.0ml接种至肉肝胃酶消化汤、普通斜面及营养肉汤中，37℃观察3～7d，无菌生长为合格，将脱毒后的培养物4000r/min离心10min，上清0.4ml静脉注射16～20g小白鼠5只，无小白鼠死亡为合格；S2：赋性剂的配制，按赋性剂配制方法配制铝胶，使培养物与铝胶的比例为5:1为宜，使每毫升菌苗中含铝胶7mg为准，充分混用后，分装待用；S3：菌苗的安检、无菌检验，随机抽取分装好的菌苗，吸取培养物0.5～1.0ml接种至肉肝胃酶消化汤、普通斜面及营养肉汤中，37℃观察3～7d，无菌生长为合格，将菌苗摇匀后皮下注射16～20g小白鼠1.0ml，小白鼠全部健活为合格。...

【技术特征摘要】
1.一种羊瘁狙疫疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1菌株的筛选：S1：菌株厌气培养，将19株分离菌株分别接种到肉肝胃酶消化汤培养基中，37℃培养12h，抹片镜检呈单一的梭状杆菌，革兰氏染色阳性；S2：DNA检测，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取19株菌株的DNA，利用设计的16SrRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖电泳检测可在1450bp处检测到目的条带，将扩增产物测序分析，与GENBANK中公布的C型产气荚膜梭菌的同源性在99％以上，证明菌株血清型符合C型产期荚膜梭菌属的特性；步骤2菌株的培养：将步骤1检测后的菌株接种到基础培养基中，37℃厌气培养，培养时间为2～24h，pH为7.5～8.8，收集培养液备用；步骤3菌株毒力验证：将步骤2的培养菌物在不同培养时间取样，4000r/min离心10min，上清液做递倍稀释，稀释比例为1:10，1:100，1:200，1:400，1:600，1:800及1:1000，皮下注射16～20g小白鼠，观察小白鼠死亡情况；步骤4疫苗制备：S1：杀菌、脱毒，将步骤2的收集的培养液按总体积的0.8％加入甲醛溶液，充分摇匀后，排出气体，38℃下杀菌3～5d，脱毒14～21d后，吸取培养物0.5～1.0ml接种至肉肝胃酶消化汤、普通斜面及营养肉汤中，37℃观察3～...

【专利技术属性】
技术研发人员：李生庆，张西云，胡国元，刘怀新，王亭亭，
申请(专利权)人：青海省畜牧兽医科学院，
类型：发明
国别省市：青海,63