鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗制造技术

本申请提供了一种免疫组合物及亚单位疫苗，包含：采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子以及SEQ ID NO:2的核酸分子或者与SEQ ID NO:2的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子分别编码的鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白以及S2蛋白，S1蛋白和S2蛋白之间能够形成异二聚体结构，和病毒表面结构类似，这两个蛋白使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到2‑3g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。

Genetically engineered subunit vaccine against infectious bronchitis in chickens

【技术实现步骤摘要】
鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗
本申请涉及动物免疫药物
，具体而言，涉及一种鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗。
技术介绍
传染性支气管炎(AvianInfectiousBronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(AvianInfectiousBronchitisVirus,IBV)引起的一种鸡的急性、高度接触传染性的呼吸道病和泌尿生殖道疾病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏为主要特征。各种日龄性别和品种的鸡都有易感性，但以6周龄以下雏鸡更易感染。没有获得母源抗体的雏鸡感染传染性支气管炎病毒后引起永久性的输卵管损伤，到性成熟丧失产蛋能力，甚至可由于呼吸道或肾脏的感染而死亡。产蛋鸡群感染传染性支气管炎病毒后导致产蛋量下降，蛋形不整、畸形和质量低下，受精率降低，传染性支气管炎还使鸡的增重和饲料报酬降低。虽然疫苗的使用对传染性支气管炎的流行起到了一定的预防和控制作用，但由于传染性支气管炎病毒血清型众多，不同血清型毒株之间具有较小的交叉保护性甚至无交叉保护性。因此，传染性支气管炎目前仍在免疫鸡群和非免疫鸡群发生和传播，给养禽业造成了严重的经济损失。IBV属于Nido病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)中第三群的成员。病毒基因组由单股不分节段的正链RNA组成，长约27.6kb。含有4种结构蛋白，即纤突(Spike，S)糖蛋白、核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白、膜(Membrane，M)糖蛋白和小膜(SmallEnvelope，E)糖蛋白。现有专利几乎均为全病毒灭活疫苗或者活疫苗，比如CN103007272A中所公开的IBV疫苗为活疫苗，通过悬浮细胞培养生产全病毒，需要血清同时存在散毒风险，且抗原表达量低；同时现有的疫苗是用鸡胚生产的，鸡胚难以处理，易造成污染。CN104353070A公开了一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗及其制备方法，其使用鸡支气管炎病毒H120毒株S1基因和H3N2流感病毒HA2基因融合表达，利用昆虫杆状病毒表达系统进行制备，但是昆虫细胞糖基化和动物细胞存在较大差异。本专利技术因此而来。
技术实现思路
本申请旨在提供一种免疫组合物，以解决现有技术中的问题。为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种免疫组合物，包含：采用SEQIDNO:1的核酸分子或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡传染性支气管炎病毒重组S1蛋白以及SEQIDNO:2的核酸分子或者与SEQIDNO:2的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子别编码的鸡传染性支气管炎病毒重组S2蛋白。本专利技术进一步的技术方案是：所述的鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白包含SEQIDNO:3的氨基酸序列或者与SEQIDNO:3的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；以及SEQIDNO:4的氨基酸序列或者与SEQIDNO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。本专利技术的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡传染性支气管炎病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防鸡传染性支气管炎病毒感染的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种核酸分子组合物，其可以用于编码鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白，包含SEQIDNO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列；以及SEQIDNO:2的顺序核苷酸序列或者与SEQIDNO:2的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。本专利技术实施例还提供了一种重组真核表达载体pCI-S1-GS；所述载体包含用于编码鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白的SEQIDNO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。本专利技术实施例还提供了一种重组真核表达载体pCI-S1-S2-GS，所述载体包含用于编码鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白的SEQIDNO:2的顺序核苷酸序列或者与SEQIDNO:2的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。进一步的，所述的重组真核表达载体主要是通过在表达载体的pCI的CMV启动子下插入所述的基因而形成。本专利技术的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡传染性支气管炎病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于预防动物受鸡传染性支气管炎病毒感染的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：SEQIDNO:3的氨基酸序列或者与SEQIDNO:3的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；以及SEQIDNO:4的氨基酸序列或者与SEQIDNO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。本专利技术实施例还提供了导入所述重组真核表达载体的高表达目的基因的单克隆宿主哺乳细胞。所述CHO细胞系可以是为DG44,DXB11,CHO-K1,CHO-S细胞株，优选的，CHO-S细胞株。本专利技术实施例还提供了所述免疫组合物、所述基因或者所述重组哺乳动物细胞在制备鸡传染性支气管炎病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。本专利技术实施例还提供了鸡传染性支气管炎病毒基因工程亚单位疫苗，其包含所述的免疫组合物。进一步的，所述疫苗包含药学上有效量的的免疫组合物。进一步的，所述的疫苗还包含赋形剂和/或佐剂，佐剂可以是包括白油(M52)、硬脂酸铝、司本、吐温中的任意一种或两种以上的组合。本专利技术目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的IBV基因工程亚单位疫苗。为达到以上目的，本专利技术使用中国仓鼠卵巢细胞CHO-S细胞共表达IBVS1蛋白和S2蛋白，而且，S1蛋白和S2蛋白之间能够形成异二聚体结构，和病毒表面结构类似，能够激发中和抗体。本专利技术公开了一种CHO细胞表达的重组鸡传染性支气管炎病毒蛋白以及亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在鸡体内产生较强的体液免疫，免疫后的鸡能够抵御强毒攻毒，属于动物疫苗与兽用生物制品
，本专利技术还提供一种可大规模工业化生产的鸡传染性气管炎病毒重组亚单位疫苗的制备方法：首先克隆包含S1蛋白编码基因以及截短的S2基因表达框的真核表达载体；然后转染CHO细胞，通过选择，筛选得到悬浮稳定高效共表达S1-S2蛋白的CHO细胞株；通过发酵培养高效表达S1-S2蛋白的细胞株，纯化后得到重组S1-S2蛋白；最后将重组S1-S2蛋白与佐剂充分混匀得到重组表达亚单位疫苗。本专利技术提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，且产量高达2-3g/L，不仅缩短了蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤，也大大降低了疫苗生产成本。采用上述方案后，本专利技术与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：本专利技术的免疫组合物不涉及全病毒，具有天然安全性，通过此方法的表达量非常高，分泌到上清液中，易于纯化，动物细胞真核表达表达糖基化修饰完善，最接近原始的分子，悬浮培养，易于大规模生产。本专利技术使用CHO细胞表达IBV重要抗原蛋白S1-S2蛋白，使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到2-3g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫组合物，包含：采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡传染性支气管炎病毒重组S1蛋白；以及SEQ ID NO:2的核酸分子或者与SEQ ID NO:2的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡传染性支气管炎病毒重组S2蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种免疫组合物，包含：采用SEQIDNO:1的核酸分子或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡传染性支气管炎病毒重组S1蛋白；以及SEQIDNO:2的核酸分子或者与SEQIDNO:2的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡传染性支气管炎病毒重组S2蛋白。2.根据权利要求1所述的免疫组合物，所述的鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白包含：SEQIDNO:3的氨基酸序列或者与SEQIDNO:3的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQIDNO:4的氨基酸序列或者与SEQIDNO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。3.权利要求1所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡传染性支气管炎病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。4.权利要求1所述的免疫组合物用于制备鸡传染性支气管炎病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。5.一种核酸分子组合物，其可以用于分别编码鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白，包含SEQIDNO:1的顺序核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文龙，孔迪，滕小锘，易小萍，张大鹤，
申请(专利权)人：苏州世诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32