一种传染性喉气管炎粘膜疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种传染性喉气管炎粘膜疫苗、制备方法及应用，所述传染性喉气管炎粘膜疫苗包含灭活的传染性喉气管炎病毒和鞭毛素；所述鞭毛素为大肠杆菌源鞭毛素；所述传染性喉气管炎病毒为传染性喉气管炎病毒疫苗株K317。所述传染性喉气管炎粘膜疫苗通过添加鞭毛素作为粘膜免疫佐剂，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应；安全性好、不存在散毒的危险；可直接应用于预防家禽免于传染性喉气管炎病毒的感染及传播。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽医生物医药
，尤其涉及一种传染性喉气管炎粘膜疫苗及其制备方法。
技术介绍
传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis, ILT)是由抱疫病毒科(Herpetoviridae)抱疫病毒属(Herpesvirus)的传染性喉气管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitis virus, I LTV)引起的一种急性呼吸道传染病,可引起鸡死亡和产蛋下降，造成生产的严重损失。严重感染时病鸡呼吸困难、喘气、咳出血样粘液，死亡率高。ILT是家禽的第一个研制出有效疫苗的主要病毒性疾病。目前，疫苗免疫接种仍是我国控制家禽ILT的主要措施。尽管弱毒疫苗存在散毒的危险，但是目前主要还是使用弱毒疫苗来预防ILT，所使用的弱毒疫苗是经细胞传代或鸡胚传代致弱的病毒以及经选择的地方流行的温和型毒株，他们都能使易感鸡产生坚强的免疫力，但弱毒疫苗存在毒力偏强、易于返祖、并且与强毒株一样能形成潜伏感染等弊端。弱毒疫苗的接种方法主要有点眼、喷雾和饮水等方式。实际应用中的弱毒疫苗的病毒毒力普遍偏强，接种后鸡群发病率在5%左右，而进一步致弱的疫苗株其免疫原性也下降，进而导致免疫效果不佳。粘膜免疫和粘膜疫苗具有许多引人关注的特性，然而要真正通过抗原的粘膜免疫途径刺激产生强大的粘膜免疫反应(包括粘膜特异的SlgA和CTLs)和保护效应并非那么容易。目前只有极少数几种粘膜免疫途径的疫苗用于临床。有效的佐剂可以大大加强疫苗刺激机体有效的保护性免疫应答，而研发新型粘膜疫苗配方的一个最明显的限制在于缺乏有效的佐剂。因此，筛选合适免疫佐剂，研制新型ILT疫苗，增强疫苗免疫效力，成为研制传染性喉气管炎粘膜疫苗的重点。
技术实现思路
为了克服现有佐剂效果差的问题，本专利技术提供一种传染性喉气管炎粘膜疫苗，该传染性喉气管炎粘膜疫苗使用鞭毛素作为佐剂。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种传染性喉气管炎粘膜疫苗，包含灭活的传染性喉气管炎病毒和鞭毛素。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的一种优选实施方式，所述鞭毛素为大肠杆菌源鞭毛素。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的一种优选实施方式，所述传染性喉气管炎病毒为传染性喉气管炎病毒疫苗株K317。一种传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法，包括以下步骤步骤1:将传染性喉气管炎病毒用10日龄SPF鸡胚进行培养和传代；步骤2 :将传染性喉气管炎病毒进行灭活；步骤3 :将大肠杆菌源鞭毛素在原核表达系统中表达，纯化，去内毒素；步骤4 :将大肠杆菌源鞭毛素与灭活的传染性喉气管炎病毒进行混合制成传染性喉气管炎粘膜疫苗。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤I中的传染性喉气管炎病毒为疫苗株K317。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤2中的灭活采用的是热处理，样品置65°C水浴或者65°C培养箱中放置2h灭活。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤2还包括病毒的活性检测和细菌检测。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤3中选用的鞭毛素来源于大肠杆菌。本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗在制备预防传染性喉气管炎的药物中的应用。本专利技术提供的新型的传染性喉气管炎粘膜疫苗具有明显的优点和效果。(I)传染性喉气管炎粘膜疫苗能引起机体免疫系统产生强型应答，免疫力强，持续时间长，可以作为预防传染性喉气管炎。(2)由于该新型疫苗的 抗原是灭活病毒，安全、不存在散毒的危险。(3)和一般的灭活疫苗比较，通过添加鞭毛素作为粘膜免疫佐剂，激发内在免疫应答，同时增强目标靶点对疫苗抗原产生的抗体反应，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应，预防家禽传染性喉气管炎。附图说明图1灭活病毒接胚后活性检测结果；第一泳道为DL2000 Marker ;第二和三泳道为阳性对照；第四和五泳道为检测样品。图2重组蛋白的可溶性分析结果；第一泳道为pET-His-Flagellin诱导表达上清；第二泳道为pET-His-Flagellin诱导表达沉淀。图3纯化鞭毛素蛋白的SDS-PAGE图；第一泳道为Marker，第二泳道为纯化后的鞭毛素蛋白；图4牛血清白蛋白标准曲线；图5 —免后16小时血清抗体ELISA值；图6 —免后I周血清抗体ELISA值；图7 —免后2周血清抗体ELISA值；图8 二免后第2周血清抗体ELISA值；图9 二免后第3周血清抗体ELISA值；图10肺洗液早期炎性细胞因子IL-6 ELISA值；图11肺洗液早期炎性细胞因子IFN Y ELISA值。具体实施例方式通过下面给出的某些实验的具体实施例子可以进一步清楚地理解本专利技术。但下述实施例不是对本专利技术的限定。一种传染性喉气管炎粘膜疫苗，包含灭活的传染性喉气管炎病毒和鞭毛素。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的一种优选实施方式,所述鞭毛素为大肠杆菌源鞭毛素。近年来，研究证明运动性革蓝氏阴性细菌的鞭毛素是一种具有潜力的免疫佐齐U，能有效诱发固有性免疫应答和适应性免疫应答。伤寒杆菌(Salmonllena enteritidis)的鞭毛素作为鼻腔内免疫佐剂能在小鼠体内诱导有效防御致死量鼠疫耶氏菌(Yersiniapestis)的呼吸道感染。创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的鞭毛素作为鼻腔内免疫佐剂与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT) 一起免疫小鼠能诱导有效的保护免疫效应。更重要的是，体内已产生存在的鞭毛素特有免疫性并不会削弱鞭毛素融合蛋白疫苗的有效性。作为一个细菌Toll样受体(Toll-like rec印tor，TlR)激动剂，鞭毛素可激发内在的免疫应答，从而产生一个非特异性的免疫反应。由鞭毛素激发的内在免疫应答可同时增强目标靶点对疫苗抗原产生的抗体反应，从而得到一个更为保护和持久的免疫作用。但是目前关于大肠杆菌来源的鞭毛素的研究较少。大肠杆菌来源的鞭毛素蛋白属于肠道病原的大肠杆菌鞭毛素，能激发产生白细胞介素_8，作为佐剂效果更好。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的一种优选实施方式，所述传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis virus, ILTV)属于疱疫病毒科(Herpetoviridae)疱疫病毒属(Herpesvirus),为传染性喉气管炎病毒疫苗株K317,购自中国兽药监察所。一种传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法，包括以下步骤步骤1:将传染性喉气 管炎病毒用10日龄SPF鸡胚进行培养和传代；步骤2 :将传染性喉气管炎病毒进行灭活；步骤3 :将大肠杆菌源鞭毛素在原核表达系统中表达，纯化，去内毒素；步骤4 :将大肠杆菌源鞭毛素与灭活的传染性喉气管炎病毒进行混合制成传染性喉气管炎粘膜疫苗。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤I中的传染性喉气管炎病毒为疫苗株K317。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤2中的灭活采用的是热处理，取足量保存备用样品置65°C水浴或者65°C培养箱中放置2h灭活，分装到2ml灭菌离心管中。作为本专利技术传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤2还包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种传染性喉气管炎粘膜疫苗，其特征在于，包含灭活的传染性喉气管炎病毒和鞭毛素。

【技术特征摘要】
1.一种传染性喉气管炎粘膜疫苗，其特征在于，包含灭活的传染性喉气管炎病毒和鞭毛素。2.根据权利要求1所述的传染性喉气管炎粘膜疫苗，其特征在于，所述鞭毛素为大肠杆菌源鞭毛素。3.根据权利要求1所述的传染性喉气管炎粘膜疫苗，其特征在于，所述传染性喉气管炎病毒为传染性喉气管炎病毒疫苗株K317。4.一种权利要求1所述的传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤1:将传染性喉气管炎病毒用10日龄SPF鸡胚进行培养和传代； 步骤2 :将传染性喉气管炎病毒进行灭活； 步骤3 :将大肠杆菌源鞭毛素在原核表达系统中表达，纯化，去内毒素； 步骤4 :将大肠杆菌源鞭毛素与灭活的传染性喉气管炎病毒进...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永长，薛春宜，鄢慧民，王林果，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：