本发明专利技术涉及一种禽流感（H9亚型）、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗及其制备方法。该疫苗是针对国内禽类疫病中，H9亚型禽流感与大肠埃希氏菌多混合感染的流行形势，提出了一个有效应对策略，并做到一次免疫同时防控两种疾病。该疫苗利用H9亚型禽流感病毒LG1株和禽源大肠埃希氏菌QL1株（O1）、QL2株（O2）、QL78株（O78）、QL36株（O36）作为疫苗制备用菌毒株，经过抗原液制备、灭活、浓缩、按照一定比例混合制备而成。本发明专利技术涉及到的H9亚型禽流感毒株、禽源大肠埃希氏菌菌株均为国内流行菌毒株，能够有效预防目前流行疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
禽大肠埃希氏菌病又称禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis),指部分或全部由大肠埃希氏菌(Escherichia coli, E. coli)所引起的局部或全身性感染的疾病,可以引起胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎和全眼球炎(Calnek B W主编(高福，苏敬良主译).禽病学.第10版.北京中国农业出版社，1999，158-171)等一系列病征，是2至12周龄的鸡和火鸡的一种常见传染病，给养禽业造成了严重的经济损失。大肠杆菌血清型极多，已知大肠杆菌有菌体(0)抗原173种，表面(K)抗原103种，鞭毛抗原60种。病原性大肠杆菌的许多血清型可引起多种动物发病。世界许多国家已经做了详细调查，确定最常与禽病有关的血清型是01、02、036和078，很少分离到其他血清型。国内学者绍华斌、霍龙飞和刘瑞田等也得出过相同结论(李树博.当前禽大肠杆菌病的流行特点与防控措施.现代畜牧兽医 2011. 12，39-40)。低致病性禽流感(Mildlypathogenic avian influenzavirus, MPAIV)在实验室条件下，受感染鸡死亡率很低，但是和E. coli混合感染时，死亡率会有不同程度的提高，鸡产蛋率锐减，肉鸡增重减少(Swayne D E, Pathobiology ofH5N2Mexican avian inf iuenzavirus infections of chickens. Vet Pathel. 1997，34 (6) : 557-567)。其中，H9 亚型禽流感病毒是导致低致病性禽流感发生、流行的诸多因素中较为重要的一种。由于低致病性禽流感和禽埃希氏大肠菌病两种疾病极易发生混合感染，而且混合感染后发病率高、危害大，这种背景下，研制一种可同时预防这两种疾病的疫苗显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术目的是通过自行分离的一株H9亚型禽流感病毒株和四株禽大肠埃希氏菌菌株(血清型分别为01、02、036、078)，提供一种可同时预防H9亚型禽流感和禽大肠埃希氏菌病两种疾病的疫苗，一次免疫即可预防两种疾病。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案在于1.禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗中该疫苗含有该疫苗含有灭活的H9亚型禽流感病毒和灭活的01、02、036和078四个血清型禽源大肠埃希氏菌。2.本专利技术所述禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗的制备方法(I)分别按常规方法用鸡胚繁殖H9亚型禽流感病毒制备成灭活并经浓缩的病毒液；用含0. 1%微量盐溶液的马丁肉汤分别培养的四型禽源大肠埃希氏菌菌液，经灭活和浓缩，再按3:3:2:2的体积比例混合成四型禽源大肠埃希氏菌灭活浓缩菌液；(2)将以上制备的灭活并经浓缩的H9亚型禽流感病毒液与四型禽源大肠埃希氏菌灭活浓缩混合菌液按1:1体积比混合后制备成水相，再按常规方法制备灭活佐剂疫苗。3.给鸡接种有效剂量的禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗能使接种鸡获得对H9亚型禽流感病毒和禽源大肠埃希氏菌国内流行菌毒株产生有效预防的免疫力。具体实施例方式1.疫苗生产用菌毒株(I)菌毒株来源本专利技术生产用毒株为一株H9亚型禽流感病毒株LGl株，为我单位自行分离、保存，并已经商品化，产品名称鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗，产品批准文号兽药生字(2010) 150252152。本专利技术生产用菌株为四株禽源大肠埃希氏菌(或大肠埃希氏菌Escherichiacoli, E. coli)菌株 QLl 株、QL2 株、QL36、QL78 株，分别为四个血清型:01、02、036、078，是由本专利技术人由野外分离得到。以上菌株已与2013年01月31日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号QLl 株为 CGMCC No. 7241，QL2 株为 CGMCC No. 7242，QL36 株为 CGMCC No. 7243和 QL78 株为 CGMCC No. 7244。(2)菌毒株特性I)免疫原性 H9亚型禽流感病毒株LGl株免疫鸡HI抗体几何平均滴度应> 6. 51og2,免疫原性良好。禽源大肠埃希氏菌菌株用I月龄SPF鸡8只，每只颈部皮下注射疫苗0. 5ml，21日后连同条件相同的对照鸡8只，各肌肉或腹腔注射强毒菌株QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)的混合菌液0. 5ml (按照菌数1:1:1:1混合，共含活菌2 5亿)。观察10日，对照鸡应全部发病或死亡，剖检后全部具有典型病变(反应在++以上)；免疫鸡至少保护6只。判定标准土有轻微临床反应，减食、排白色粪便I 3日，内脏无肉眼可见病变。+临床减食4日以上或停食I日以上，排黄白色粪便4日以上，剖检见心脏或肝脏有轻度纤维素渗出性炎症。+ +临床同(+)，可见明显心包积液及纤维素渗出性炎症。+ + +临床同(+ )，有严重心包膜炎，并与肝或胸膜发生粘连。+ + + +试验鸡死亡，其他同(+ ++ )。2)毒力H9亚型禽流感病毒株LGl株将毒种用灭菌生理盐水作5 15倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚20个，每胚0.1 0. 3ml，置37°C孵育，在接种后48 96小时内，至少有15个鸡胚死亡。禽源大肠埃希氏菌QLl株(01)、QL2株(02)、QL36株(036)、QL78株(078)菌株含0.1%微量盐溶液(制作方法见中华人民共和国兽用生物制品规程，二〇〇〇版，81页)的马丁肉汤20 24小时培养菌液0. 3 0. 6ml(含活菌2 5亿)，肌肉或腹腔注射I月龄SPF鸡5只，应出现明显临床症状，于14日内死亡或活鸡内脏有明显病变，应在(++)以上。3)禽源大肠埃希氏菌血清型根据国内目前禽源大肠埃希氏菌病流行情况，本专利技术选取了四个血清型中免疫原性优良的菌株作为制苗用菌株，分别为01，02，036，078血清型中的QLl株、QL2株、QL36株、QL78 株。2.禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗的生产制备(I)抗原液制备I) H9亚型禽流感病毒液制备①毒种繁殖将H9亚型禽流感病毒株LGl株生产用毒种用灭菌生理盐水作500 1500倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 0. 3ml，收获24 96小时内死亡的鸡胚液，装于灭菌容器内，红细胞凝集价不低于1:256。②接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作500 1500倍稀释，尿囊腔内接种9 11日龄健康易感鸡胚，每胚0.1ml。接种后S封针孔，直36 37 C继续鮮育，不必翻蛋。③孵育和观察鸡胚接种后，24小时照蛋I次，弃去死胚。以后每4 8小时照蛋I次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2 8°C冷却4 24小时。④收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌方法剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液。在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、`胚液混浊及有任何污染可疑者本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种禽流感（H9亚型）、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗，其特征是该疫苗含有灭活的H9亚型禽流感病毒和灭活的O1、O2、O78和O36四个血清型禽源大肠埃希氏菌（Escherichia?coli）。
【技术特征摘要】
1.一种禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗，其特征是该疫苗含有灭活的H9亚型禽流感病毒和灭活的Ol、02、078和036四个血清型禽源大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。2.—种权利要求1所述的禽流感(H9亚型)、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于 (1)分别按常规方法用鸡胚繁殖H9亚型禽流感病毒制备成灭活并经浓缩的病毒液；用含0. 1%微量盐溶液的马丁肉汤分别培养的四型禽源大肠埃希氏菌菌液，经灭活和浓缩，再按3...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍海忠，鞠洪涛，宋晓飞，王蕾，徐龙涛，吴昊，
申请(专利权)人：齐鲁动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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