一种鸡亚单位三联疫苗及其制备和应用制造技术

本发明专利技术的目的是制备一种可以同时预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性法氏囊病特别是超强毒感染的疫苗，包含有序列为SEQ?ID?NO：1的鸡传染性法氏囊病VP2蛋白和新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒。本发明专利技术三联疫苗免疫21日龄的鸡，可同时预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性法氏囊病，免疫效果与鸡新城疫单苗、鸡传染性支气管炎灭活疫苗及鸡传染性法氏囊病单苗效果相似，达到了减少免疫次数，降低应激的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡亚单位三联疫苗及其制备和应用
本专利技术属于禽类疫苗制造领域，具体涉及一种鸡亚单位三联疫苗及其制备和应用，即一种鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊病三联疫苗。
技术介绍
鸡新城疫(newcastle disease，ND)是由鸡新城疫病毒(NDV)引起的禽类急性传染病，传播速度快，长期以来给我国养禽业带来了巨大的威胁。鸡新城疫活疫苗虽然效果好、 价格低廉、使用方便，但其免疫期短、免疫易受母源抗体干扰，且容易引起呼吸道副作用，干扰实验室诊断病毒分离，因此，1980年以来，使用鸡新城疫灭活疫苗逐渐成为我国鸡场防治鸡新城疫的常规方法之一。鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)又称鸡传染性腔上囊病， 是由传染性法氏囊病毒引起的一种急性、接触传染性疾病。以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征，能够引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果。 该病发病率高，是目前养禽业最重要的疾病之一。而且，近年来由于超强毒的出现，传统的疫苗免疫失败屡屡发生，因此，有必要筛选鸡传染性法氏囊病毒的不同等位基因，并借助基因工程亚单位疫苗的方法为鸡传染性法氏囊病预防提供了一条新的途径。鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis, IB)是急性接触性传染性呼吸道疾病，其特征为病鸡咳嗽、喷嚏、气管啰音，蛋鸡产蛋数量和质量下降。IB为世界各国集约化养鸡普遍存在的疫病，有的地区阳性率可达100%。我国主要流行的病原血清型是 Massachusetts型，该型毒株异型毒株也能产生较好的免疫力，我国普遍选用M41株做为疫苗毒株。为了有效控制ND、IB和IBD，减少接种次数，便于生产应用，因此，有必要提供一种鸡新城疫、传染性支气管炎和传染性法氏囊病三联疫苗来满足市场的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是制备一种可以同时预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性法氏囊病特别是超强毒感染的疫苗，其中的鸡传染性法氏囊病部分是采用大肠杆菌表达的主要抗原保护性蛋白VP2蛋白制成的亚单位疫苗。本专利技术的三联疫苗由抗原和疫苗辅剂组成，所述的抗原为鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和序列为SEQ ID NO 1的鸡传染性法氏囊病VP2蛋白。上述的三联疫苗的制备方法，是将新城疫病毒接种鸡胚后，收获胚液加入甲醛灭活；将鸡传染性支气管炎病毒接种鸡胚后，收获胚液加入甲醛灭活；然后将灭活的新城疫病毒胚液、鸡传染性支气管炎病毒胚液与鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白混合后，加入疫苗佐剂乳化制成的。上述的新城疫病毒为新城疫病毒Clone30。上述的传染性支气管炎为传染性支气管炎M41。本专利技术三联疫苗免疫21日龄的鸡，可同时预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性法氏囊病，免疫效果与鸡新城疫单苗、鸡传染性支气管炎灭活疫苗及鸡传染性法氏囊病单苗效果相似，达到了减少免疫次数，降低应激的目的。具体实施例方式IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是最主要宿主保护性抗原，本专利技术是用PCR方法扩增了 IBD超强毒的VP2基因，克隆到pET-28a载体上，转化BL21 (DE3)，经IPTG诱导后VP2蛋白获得了表达，将表达菌体高压匀浆破碎后离心取上清即为VP2蛋白溶液。新城疫病毒Clone30株接种10日龄SPF胚，收取培养48 96小时的鸡胚液，超滤浓缩法将病毒液浓缩，加入终浓度为0. 1%的甲醛。鸡传染性支气管炎病毒M42株接种l(Tll日龄SPF胚，收取培养24 48小时的鸡 胚液，超滤浓缩法将病毒浓缩，加入终浓度为0. 1%的甲醛。将VP2蛋白液与新城疫病毒液、鸡传染性支气管炎病毒液混合后乳化配苗。下面结合具体的实施例对本专利技术的鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊病毒VP2亚单位三联疫苗进行详细的描述。一、新城疫病毒液的制备将新城疫病毒Clone30株(购自中国兽医药品监察所)，用灭菌生理盐水做适当稀释，经尿囊腔接种扩10日龄易感鸡胚，每胚0. 1ml，接种后密封针孔，直36 37°C继续孵育。弃去48小时前死亡鸡胚，此后4 8小时照蛋一次，死亡胚随时取出，直至96小时全部取出，置疒8°C冷却12 24小时。收获鸡胚尿囊液及羊水，弃去血凝价低于1:128，进行无菌检验。新城疫病毒液的浓缩将收获的病毒液用二级预过滤柱除去大颗粒杂质，然后用病毒超滤法浓缩系统将新城疫病毒液浓缩至原体积的1/4。灭活将浓缩后的病毒液置于灭活罐内，加入终浓度为0. 1%的甲醛，随加随搅拌，使其充分混合。37°C灭活16小时。二、鸡传染性支气管炎病毒液的制备将鸡传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)用灭菌生理盐水适当稀释，经尿囊腔接种l(Tll日龄易感鸡胚，每胚0. lml，接种后密封针孔，直36 37°C继续孵育。弃去24小时前死亡鸡胚，此后4飞小时照蛋一次，死亡胚随时取出，直至48小时全部取出，置2 8°C冷却12 24小时。收获鸡胚尿囊液及羊水。鸡传染性支气管炎病毒液的浓缩将收获的病毒液用二级预过滤柱除去大颗粒杂质，然后用病毒超滤法浓缩系统将新城疫病毒液浓缩至原体积的1/4。灭活将浓缩后的病毒液置于灭活罐内，加入终浓度为0. 1%的甲醛，随加随搅拌，使其充分混合。37°C灭活16小时。三、VP2基因的筛选用Primer5. 0软件设计了一对扩增鸡传染性法氏囊病病毒VP2全基因引物，并在上游引物5'端加入保护性碱基及BamH I酶切位点，在下游引物的5'端加入保护性碱基和Xho I酶切位点，引物序列为Primer I 5/ -GCG TCG ACA TGA CAA ACC TGC AAG ATC - 3'Primer 2 5/ -CCC TCG AGT TAT CCT TAT GGC CCG GAT T -3'取200 μ 用临床分离的疑似IBDV的病料感染的鸡胚接种尿囊膜悬液上清液，按 RNAisoReagent说明书所述方法提取病毒RNA,按反转录试剂盒使用说明书进行反转录合成cDNA，进行PCR扩增，扩增体系为(50 μ ):10XPCR Buffer δμΙ, ΝΤΡ (IOmM each) μ , 上、下游引物(IOmM)各 μ ，cDNA 3 μ , 25mM MgC12 4 μ , Taq酶(5υ/μ1 ) μ1，(ΜΗ20 34μ1 ;PCR 反应参数95 °C 5min，95°C lmin，58°C 2min，72°C 2min，35 个循环，72 °C IOmin。得到一个1300bp左右的片段，切胶回收该片段，与pMD-18T载体连接。PCR回收片段 6μ1，Τ 载体 2μ1 (稀释 10 倍后)，T4 DNA 连接酶 μ1，Τ4 buffer 2. 5μ1，水13. 5μ1，总计25μ1。16°C过夜连接，取20 μ 连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，挑选10个白色菌落培养，提取质粒鉴定正确的选取3个测序，结果3个质粒的测序结果都一致，证明获得的核苷酸片段在扩增的过程中没有产生错误，其核苷酸序列为SEQ ID Ν0:2，翻译的氨基酸序列为 SEQ ID NO: I。将该核苷酸序列在NCBI上Blast比对，有十几个碱基发生了点突变，表明该毒株为一株新的流行毒株。这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三联疫苗，由抗原和疫苗辅剂组成，所述的抗原为鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和序列为SEQ?ID?NO：1的鸡传染性法氏囊病VP2蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种三联疫苗，由抗原和疫苗辅剂组成，所述的抗原为鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和序列为SEQ ID NO 1的鸡传染性法氏囊病VP2蛋白。2.如权利要求I所述的三联疫苗，其特征在于所述的鸡新城疫病毒为新城疫病毒Clone30o3.如权利要求I所述的三联疫苗，其特征在于所述的鸡传染性支气管炎病毒为鸡传染性支气管炎病毒M41。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雷，凌红丽，蒋皓静，杨光烈，
申请(专利权)人：青岛康地恩药业股份有限公司，青岛宝依特生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：