本发明专利技术提供了一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗及其制备方法，其中，三种病毒的含量≥107.5TCID50/mL，体积比为1∶1∶1。本发明专利技术的三联活疫苗解决了目前市场上缺少的有效的防治猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒三种疾病的多联疫苗的问题，尤其是对猪轮状病毒的防控。和现有的打三针单疫苗才能预防这三种传染病比较，该发明专利技术经济使用，简化了免疫程序，降低了防疫成本，为国内养殖场提供了一种简单方便的新的免疫途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多联动物活病毒疫苗，特别是指一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗。
技术介绍
猪传染性胃肠炎(TGEV)是猪的一种高度接触性肠道传染病，发病急，传播快，各 种年龄的猪只都可以感染，以引起7 10日龄以内仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率(通常100% )为特征，而周龄较大或成年猪只虽然几乎没有死亡，但是掉膘、降低饲料报酬，增加药物和人力等所造成的经济损失是非常严重的。该病是世界性的疾病之一。猪流行性腹泻(PED)是一种急性、高度接触性的传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪的高死亡率为特征。PEDV主要通过被感染猪只排出的粪便或污染物经口途径自然感染。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%，尤以哺乳仔猪受害最为严重，母猪发病率为15% 90%。PEDV病毒主要寄生在小肠，也以细胞免疫为主。猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)，也是引起幼龄猪的急性消化道传染病，该病毒主要存在肠道内，随粪便排到外界环境。能感染各年龄段的猪，以2 5周龄的仔猪多发，仔猪死亡率达50% 100%，而中猪和大猪多为亚临床感染和隐性感染。猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)在抗原形态，临床症状，流行病学极其相似，唯免疫学和血清学相互没有交叉反应。轮状病毒是一种人畜共患病，在猪群中感染率也很高，在临床症状上也很难与TGEV和PEDV感染猪群区别开来，并且都是以感染仔猪为主，临床上无特效治疗药物。唯有发展联苗是预防这三种病毒的关键。目前国内仅有传染性胃肠炎和流行性腹泻二联灭活疫苗，但由于多联灭活疫苗中抗原的相互干扰等问题，在传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒与轮状病毒多联灭活疫苗方面一直也未能取得成功。现有技术中，动物疫苗常常选用灭活疫苗，因为活疫苗中使用活病毒，如弱毒株或减毒株，但是由于在实际使用中弱毒株或减毒株会出现返强的问题，因此通常避免使用活疫苗作为免疫手段，特别是多联活疫苗或多联活疫苗，由于病毒成分复杂，返强的几率更大，因此在目前市场上一直未能出现关于猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人经过大量细致地实验和认真的研究发现，目前国内已有传染性胃肠炎病毒(TGEV)和流行性腹泻病毒(PEDV) 二联灭活疫苗用于预防传染性胃肠炎和流行性腹泻这两种病，灭活疫苗免疫猪体后猪体的血清抗体水平虽然很高，但肠道局部免疫水平较差，不能达到阻止TGEV感染的目的。其次，轮状病毒感染猪只可产生血液循环抗体及肠道分泌抗体，但血清中的抗体水平和对感染的抵抗力并不相关。而TGEV和PEDV感染猪体后均能产生分泌型IgA(sIgA)，SlgA能提供对上述三种病毒的强毒攻击的免疫保护。而且TGEV和PEDV均在肠道内吸附和增殖，SlgA还能提供对TGEV和PEDV对肠道的局部免疫力，阻断TGEV和PEDV的吸附和增殖途径；此外，专利技术人还发现SlgA还能中和部分猪轮状病毒。但是，灭活病毒即灭活的TGEV和PEDV不能感染机体，也不能诱导产生slgA，因此，不能诱导产生slgA，这也是灭活病毒作为疫苗时，不能有效地同时提供免疫三种病毒的保护性免疫反应的原因。其次，本专利技术通过大量细致的试验，适当地选择了三种病毒的含量与配比，并通过较大数量的实验动物和本动物的免疫效果测定，保证多价疫苗中各个免疫成分之间不发生免疫干扰现象，也就是不 降低各该免疫成分的免疫效能，使得三价疫苗的免疫效力比二价苗的免疫效力没有明显降低，实现了本领域一直没有实现的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联疫苗的制备与应用。最后，本专利技术提供了适宜的佐剂与三种病毒混合配苗，适合而高效的超滤浓缩的处理方法，使得到三种病毒抗原的相互干扰现象降到了最低，进一步提高了多价疫苗的安全性和免疫效力。S卩，意外地，专利技术人发现本专利技术的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联活疫苗比自制的轮状病毒弱毒疫苗和市售的传染性胃肠炎与流行性腹泻二联活疫苗免疫效力都更好，而通常情况下，多价疫苗的免疫效果比单苗或二联苗的免疫效果会降低很多，因此，本专利技术的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联活疫苗可以替代现有技术中的轮状病毒弱毒疫苗和市售的传染性胃肠炎与流行性腹泻二联活疫苗，避免多次注射不必要的麻烦，节约了成本和使用免疫环节，提高了生产效率。基于上述发现和认识，本专利技术的主要目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗，抗原成分为活的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒，其中，猪传染性胃肠炎病毒的含量> 107 5TCID5(l/mL、猪流行性腹泻病毒的含量彡IO7 5TCID5cZmL和猪轮状病毒的含量彡107_ 5TCID5(l/mL。优选地，本专利技术的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的体积比为1:1:1。优选地，本专利技术的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒为弱毒株或减毒株。优选地，本专利技术的猪传染性胃肠炎病毒为保藏号CCTCC-V200609的华毒弱毒株，猪流行性腹泻病毒为保藏号为CCTCC-V200608的弱毒株，猪轮状病毒株为保藏号CVCCAV56的弱毒株。本专利技术的另一目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗，包括以下步骤I)将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量分别接种猪传染性胃肠炎病毒，并加入猪传染性胃肠炎病毒维持液，在37°C下继续培养；2)将长满致密单层的哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量分别接种猪流行性腹泻病毒，并加入猪流行性腹泻病毒维持液，在37°C下继续培养；3)将长满致密单层的哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量分别接种猪轮状病毒，并加入猪轮状病毒维持液，在37°C下继续培养；4)当细胞病变在90%以上时，分别收获病毒，并反复冻融2次后，保存于-40°C以下，备用；5)对收获的病毒液进行病毒含量和纯净性检验，病毒含量在7. 51ogl0/ml以上，纯净性检验合格的病毒用于配苗；。6)将上述检验合格的三批病毒液经过2000 5000r/min低速离心，2次微孔滤膜过滤纯化；7)将检验合格的病毒液按I : I : I体积比例混合，即得猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗。优选地，本专利技术的三联活疫苗制备方法中，所述的猪传染性胃肠炎病毒的宿主细胞，选自乳猪肾原代细胞，猪睾丸细胞，猪肾细胞或猪肾细胞；所述的猪流行性腹泻病毒的宿主细胞，选自VeiO细胞、Vero E6细胞、PK15细胞或猪肾原代细胞；所述的猪轮状病毒的 宿主细胞，选自猴肾细胞或罗猴肾细胞。优选地，本专利技术的三联活疫苗制备方法中，所述的猪传染性胃肠炎病毒的宿主细胞为猪睾丸细胞，猪流行性腹泻病毒的宿主细胞为Vero E6细胞，猪轮状病毒的宿主细胞为猴肾细胞。优选地，本专利技术的三联活疫苗制备方法中，所述的猪传染性胃肠炎病毒维持液为MEM培养基，其中MEM培养基含有非必须氨基酸。优选地，本专利技术的三联活疫苗制备方法中，所述的猪传染性胃肠炎病毒维持液中还含有 2. 2g/L 的 NaHCO3,10mg/L 的胰酶，I % DMSO (v/v)，10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的三联活疫苗，其特征在于，所述三联活疫苗中抗原成分为活的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒，其中，猪传染性胃肠炎病毒的含量≥107.5TCID50/mL、猪流行性腹泻病毒的含量≥107.5TCID50/mL和猪轮状病毒的含量≥107.5TCID50/mL。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，白朝勇，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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