猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位疫苗制造技术

本申请提供了一种免疫组合物及基因工程亚单位疫苗，包含：采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪流行性腹泻病毒S1蛋白。该疫苗使用CHO细胞真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到2‑3g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。

Recombinant subunit vaccine of porcine epidemic diarrhea virus

The present invention provides an immune composition and a subunit vaccine for genetic engineering, comprising: a nucleic acid molecule using SEQ ID NO:1 or a porcine epidemic diarrhea virus S1 protein encoded by a nucleic acid molecule that is more than 95% of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1. The recombinant cell can be cultured in large-scale suspension, which greatly reduces the complexity of vaccine preparation and production costs.

【技术实现步骤摘要】
猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位疫苗
本申请涉及动物免疫药物
，具体而言，涉及一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位疫苗。
技术介绍
猪流行性腹泻(PorcineEpidemicDiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要症状的肠道传染病。该病对各种年龄阶段的猪均易感，尤其是7日龄以内的哺育仔猪，感染后死亡率极高。PEDV为冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的成员，目前发现只有一个血清型。PEDV是具有囊膜的单链正股RNA病毒，属于I型冠状病毒。PEDVS蛋白为伸出病毒颗粒囊膜的20nm球杆形糖蛋白，分子量约为180-220kDa，约由1383个氨基酸组成，该蛋白在诱导中和抗体、调节与宿主细胞受体糖蛋白相互作用以介导病毒进入、结合细胞、促进病毒和细胞融合等方面发挥着重要作用。S蛋白可以人为分为S1蛋白和S2蛋白，S1蛋白存在识别宿主细胞上的入胞受体表位，能够促进病毒囊膜与细胞膜的融合，从而介导病毒的入侵。S1蛋白还包含PEDV主要的中和抗原表位和受体结合域，是研究开发猪流行性腹泻基因工程疫苗的重要靶蛋白。目前用于预防、控制猪流行性腹泻的疫苗较多都是传统PEDV弱毒苗和灭活疫苗，有少数基因工程亚单位疫苗。但灭活疫苗存在自身免疫保护力较弱，且存在灭活不完全，造成散毒的风险；弱毒活疫苗存在毒株毒力返强的风险。专利CN108822191A公开了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和应用，该专利使用CHO细胞表达PEDV-S蛋白，但PEDV-S基因必须进行优化后才可以使用CHO细胞进行表达，否则CHO细胞基本不表达PEDV-S蛋白。专利CN107619819A公开了一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系、疫苗和应用，该专利使用人胚胎肾细胞HEK-293T细胞表达S1蛋白，但HEK-293T细胞的表达量较CHO细胞低，且CHO细胞更成熟，较HEK-293T细胞更易培养。本专利技术因此而来。
技术实现思路
本申请旨在提供一种免疫组合物，以解决现有技术中的问题。为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种免疫组合物，包含：采用SEQIDNO:1的核酸分子或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪流行性腹泻病毒S1蛋白。本专利技术进一步的技术方案是：所述的猪流行性腹泻病毒S1蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或者与SEQIDNO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。本专利技术的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对猪流行性腹泻病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防猪流行性腹泻病毒感染的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种核酸分子，一种核酸分子，其可以用于编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白，包含SEQIDNO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。本专利技术的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱导针对猪流行性腹泻病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于预防动物受猪流行性腹泻病毒感染的药剂的用途。本专利技术的又一目的在于提供一种蛋白，其选自由以下组成的组：SEQIDNO:2、与SEQIDNO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的蛋白。本专利技术的又一目的在于提供一种适用于在受试动物体内产生针对猪流行性腹泻病毒的免疫反应的免疫组合物，包含：所述的猪流行性腹泻病毒S1蛋白，和佐剂。优选的技术方案是，所述佐剂选自MONTANIDEISA15VG,MONTANIDEISA206VG,MONTANIDEGEL01的一种或者两种以上的组合。本专利技术目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位疫苗。为达到以上目的，本专利技术使用CHO细胞表达猪流行性腹泻病毒-S1蛋白。S1蛋白是猪流行性腹泻病毒重要抗原蛋白，能够激发中和抗体。CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞。本专利技术目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位疫苗，为达到以上目的，本专利技术使用CHO细胞表达重组猪流行性腹泻病毒S1蛋白，S1蛋白包含PEDV主要的中和抗原表位和受体结合域，是诱导机体保护性免疫的主要抗原，因此更易激发产生抗体。本专利技术公开了一种CHO细胞表达的重组猪流行性腹泻病毒S1蛋白以及亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在猪体内产生较强的体液免疫，免疫后的猪能够抵御强毒攻毒，属于动物疫苗与兽用生物制品
，其目的在于提供一种可大规模工业化生产的猪流行性腹泻病毒重组亚单位疫苗的制备方法：首先克隆包含S1蛋白编码基因的真核表达载体；然后转染CHO细胞，通过选择，筛选得到悬浮稳定高效表达S1蛋白的CHO细胞株；通过发酵培养高效表达S1蛋白的细胞株，浓缩纯化后得到重组S1蛋白；最后将重组S1蛋白与佐剂充分混匀得到重组表达亚单位疫苗。本专利技术提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，且产量高达2-3g/L，不仅缩短了蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤，也大大降低了疫苗生产成本。采用上述方案后，本专利技术与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：本专利技术的免疫组合物生产过程不涉及全病毒，具有天然安全性，本案专利技术人使用的载体有GS扩增系统，可以增加目的基因拷贝数，通过CHO细胞进行表达，表达量非常高，分泌到上清中，易于纯化，哺乳动物细胞真核表达，表达糖基化修饰完善，最接近原始的分子。悬浮培养，易于大规模生产。本专利技术使用CHO细胞表达猪流行性腹泻病毒重要抗原蛋白S1蛋白，使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到2-3g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。本专利技术的亚单位疫苗可以大规模生产，供量重组，质控容易；安全性高，免疫原性好；批次间稳定；生产成本低。本专利技术使用了优化的S1蛋白序列，使用悬浮培养CHO细胞进行表达，表达量非常高，蛋白免疫原性好。附图说明图1为将S1基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果；其中1为S1基因；2为阴性对照；M为分子量标记；图2为S1基因转化的菌落样品PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，其中1～7均为S1基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，M为分子量标记；图3为实施例2中的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，其中1为单独表达S1蛋白的细胞培养物上清；2为阴性对照；M为分子量标记；图4为实施例2中单独表达S1蛋白重组CHO上清样品WesternBlot检测结果，其中1为单独表达S1蛋白重组CHO上清样品；2为阴性对照；M为分子量标记；图5为实施例2中单独表达S1蛋白的样品纯化结果；图6为构建好的重组真核表达载体pCI-S1-GS图谱；图7为使用本专利技术疫苗后，攻毒后阴性对照组与疫苗组猪小肠解剖的对比结果，上侧为阴性对照组；下侧为疫苗组。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫组合物，包含：采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪流行性腹泻病毒S1蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种免疫组合物，包含：采用SEQIDNO:1的核酸分子或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪流行性腹泻病毒S1蛋白。2.根据权利要求1所述的免疫组合物，所述的猪流行性腹泻病毒S1蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或者与SEQIDNO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。3.权利要求1所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对猪流行性腹泻病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。4.权利要求1所述的免疫组合物用于生产预防动物受猪流行性腹泻病毒感染的药剂的用途。5.一种核酸分子，其可以用于编码猪流行性腹泻病毒S1蛋白，包含SEQIDNO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQIDNO:1的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文龙，孔迪，滕小锘，易小萍，张大鹤，
申请(专利权)人：苏州世诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32