本发明专利技术属于涉及一种用于预防布氏杆菌(Brucella)感染的融合蛋白以及该融合蛋白的制备方法及其应用。具体而言，本发明专利技术涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包含布氏杆菌L7/L12蛋白ORF、布氏杆菌BLS蛋白的亚单位、T细胞抗原表位及纯化标签，本发明专利技术还涉及该融合蛋白的制备方法和药学应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及用于免疫的融合蛋白，用于预防牛布氏杆菌的感染，其由布氏杆菌L7/L12蛋白0RF、布氏杆菌BLS蛋白的亚单位、T细胞抗原表位及纯化标签序列组成，及其制备方法及应用。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人畜共患的传染变态反应性疾病。1886年英国军医Bruce在马尔他岛，从死于马尔他热的士兵脾脏中分离培养到该细菌，当时称为马尔他微球菌(Micrococcuss melitensis)。布鲁氏菌属细菌大多数种型对人畜是有致病性的，布氏菌可通过皮肤、呼吸道和消化道进入体内而感染。进入体内后，首先侵犯局部淋巴结，并在其内寄生繁殖，形成原发病灶，继而细胞破裂进入血流，造成血行播散，出现一时性菌血症和毒血症，血流中的细菌留存于淋巴结、肝、脾和骨髓等处。在细胞内繁殖，出现多发性转移病灶，释放内毒素，造成发热，并累及多个器官的损伤。在羊、牛、猪中，主要侵犯生殖器和乳腺组织，造成流产或早产。此病在世界170多个国家和地区存在人畜间布病流行，约占世界1/5 1/6的人受布病威胁，全世界布病患者约有500 600万人，每年造成的经济损失高达数十亿美元。而且此病还对人类健康造成严重威胁。年新发病人数为50万。布鲁氏菌分布不仅地区广，而且寄生的宿主也相当广泛。它们既可感染人和多种家畜，又可感染和寄生于60多种野生动物，布氏菌属细菌有6个种19个生物型组成。目前已检测出几十株布鲁氏菌噬菌体，依其对布鲁氏菌作用的特点，可分为6群1群有Tb、 A422 ；2群有Fi ；三群有WkD、M51等；4群有BK ；5群有R、Ro、Rc等；6群有Iz。其中特异性最高的为Tb和R群。它们在布氏菌分类中有重要意义。布鲁氏菌疫苗的应用现状1. 1羊种布氏杆菌Rev. 1疫苗Rev. 1被认为是一种毒力减弱株，属于光滑型。对牛、羊布氏杆菌均具有免疫保护力。此菌株作为疫苗仍具有一定的毒力，并且在适当的条件下，毒力可以完全恢复。大量的动物试验结果显示，由Rev. 1引起的流产率比$19(S19低于 1)略高，而对于某些毒力变异株，其致流产率可能更高。1. 2牛种布氏杆菌19 (B. abortus strain 19。S19)疫苗该疫苗制造用菌株是1923 年从牛奶中分离获得的，并在实验室培养过程中致弱。菌株中含有0链的脂多糖(LPS)能持续刺激机体产生抗体，对牛有一定的保护力，历史上最广泛应用的布氏杆菌疫苗为$19， 属于牛种布氏杆菌的一种。1923年在牛奶中以有毒株发现，但在实验室培养过程中却成为减毒株。菌体中含有0链的LPS能持续刺激机体产生抗体，对牛有一定的保护力，但该菌株能传染人，并会引起怀孕母畜的流产，在公畜中也限制使用。1.3牛种布氏杆菌45/20 (B abortus strain 45/20,45/20)疫苗该疫苗制造用菌株是1922年从病牛体中分离，后经豚鼠20次传代后获得粗糙型的减毒株。其优点是LPS 结构中无0链，因此免疫动物以后，在其体内检测不到0链的抗体，从而可以避免干扰诊断。该菌株作为疫苗的免疫机制仍不清楚，有人推断LPS中残留的小量0链在起作用，也有人认为菌体的一些其它有效蛋白刺激了机体的细胞免疫，但这些猜测都缺乏直接有效的证据。 粗糙型的45/20疫苗株最严重的问题是该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异， 使其毒力恢复为强毒，因此其作为疫苗的安全性仍有争议。1. 4粗糙型牛种布氏杆菌株51 (Rough strain B. abortus51, RBS1)疫苗粗糙型菌株45/20对牛种布氏杆菌感染动物具有明显的保护力这一事实说明粗糙型布氏杆菌体组织可作为引起机体免疫保护的有效抗原，关键是如何找到一株稳定性良好的粗糙型突变菌株。多年的实该疫苗株最初由光滑型牛布氏杆菌2308株经体外反复传代，并经利福平和青霉素的筛选获得。具有利福平抗性的RBSl是当前应用最为广泛的疫苗。多年的实践证明其免疫力和保护力均优于S19，并克服了以往疫苗的一些弱点。1. 5猪种布氏杆菌S2疫苗(B. suis strain 2。S2)该疫苗是用中国分离株制造的， 其毒力比S19和Rev. 1弱，对猪、牛和羊均能产生良好的免疫。由于其毒力较弱，可以通过口服或肌注的方式进行免疫，并且不会导致怀孕母畜的流产，因此在我国被广泛使用。虽然有研究认为，S2的保护率较S19和Rev. 1低约10 20，但大量的动物试验表明，S2能够提供令人满意的保护率，对超强毒的马尔他型(B. meliten-sis)布氏杆菌的攻击能提供40 60 的保护。VTRMl (羊种布氏杆菌突变株 Rough mutant B. melitensis 16M)、VTRSl (猪布氏杆菌突变株Roughmutant B. suis)RB51让人们意识到，或许羊种布氏杆菌及猪种布氏杆菌粗糙型作为疫苗都有良好的保护性，利用wboA基因断裂将Rl构建成VTRMl，因其在机体中可以长期存在并可引起强烈的CMI，故对机体的保护力大于RB51。对于VTRMl和VTRSl 的进一步研究仍在进行中。近年兴起的基因工程亚单位免疫，不仅可以产生很强的抗体应答，而且还能产生较好的细胞免疫效果。Blanco的研究发现，含有T细胞表位的多肽能增强Th细胞的活性， 并协同诱导机体产生抗病毒抗体(Blanco Ε, J Virol. 2001 ；75(7) :3164-74)。目前，尚没有见到针对布氏杆菌基因工程亚单位免疫疫苗，为了有效预防布氏杆菌，人们迫切需要一种新型、高效的疫苗来预防布氏杆菌。本专利技术提供了提供了一种新的能用于融合蛋白及其疫苗组合物，其能预防布氏杆菌的感染。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种新的能用于免疫的融合蛋白及其疫苗组合物，其能预防布氏杆菌的感染。本专利技术还提供了含有所述融合蛋白的药物组合物，如疫苗组合物。此夕卜，本专利技术还提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸以及制备该融合蛋白的方法等。在第一个方面，本专利技术提供了一种用于免疫的融合蛋白，其含有布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位、布氏杆菌BLS蛋白的亚单位和T细胞抗原表位。其中，所述布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位指的是具有免疫原性的布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位中的主要多肽或其具有基本相同免疫原性的功能等价物，优选是布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位SEQ ID No. 8。所述的布氏杆菌BLS蛋白的亚单位或其具有基本相同功能的功能等价物，优选是如SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列或其功能等价物。所述的 T细胞抗原表位指的是能够能增强Th细胞活性的抗原表位，优选是如SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或其功能等价物。本文中所用的术语“融合蛋白”是指多个蛋白质或多肽分子连接到一起所形成的新的蛋白质或多肽或其药学上可接受的盐。连接可以通过公知的遗传工程或化学合成方法来进行，优选通过遗传工程方法，即通过重组DNA技术来实现多个蛋白质或多肽分子的融合。本专利技术的融合蛋白中亦可包括一些化学修饰部分，如水溶性聚合物。优选水溶性聚合物要为药学上可接受的聚合物，如聚乙二醇，葡萄糖，聚乙烯醇，乙本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李殿明，蒲勤，李毅，赵明，田春辉，齐春梅，顾富香，
申请(专利权)人：青岛宝麦德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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